聚集誘導熒光分子修飾的核苷酸及其在DNA測序和SNPs檢測中的應用.pdf

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1、(19)中華人民共和國國家知識產權局 (12)發明專利申請 (10)申請公布號 (43)申請公布日 (21)申請號 202010195201.7 (22)申請日 2020.03.19 (71)申請人 北京師范大學 地址 100875 北京市海淀區新街口外大街 19號 (72)發明人 歐陽津孫菲菲那娜 (74)專利代理機構 北京紀凱知識產權代理有限 公司 11245 代理人 白鳳瑩 (51)Int.Cl. C07H 19/207(2006.01) C07H 19/10(2006.01) C07H 1/00(2006.01) C09K 11/06(2006.01) C12Q 1/6858(2018。

2、.01) C12Q 1/6869(2018.01) (54)發明名稱 聚集誘導熒光分子修飾的核苷酸及其在DNA 測序和SNPs檢測中的應用 (57)摘要 本發明公開了聚集誘導熒光分子修飾的核 苷酸及其在DNA測序和SNPs檢測中的應用。 本發 明首先公開了一種化合物， 該化合物為名稱為 dNTPs-HCAP的聚集誘導熒光分子修飾的核苷酸， 所述dNTPs-HCAP為dATP-HCAP、 dTTP-HCAP、 dCTP- HCAP或dGTP-HCA。 進一步公開了上述化合物在檢 測單核苷酸多態性和/或DNA測序中的應用。 本發 明利用具有雙重熒光信號的聚集誘導熒光分子 合成了dNTPs-HCAP。

3、， 并將其引入到擴增反應體系 中， 通過擴增反應前后加入蝦堿性磷酸酶并檢測 加入蝦堿性磷酸酶前后的熒光信號變化， 可用于 檢測單核苷酸多態性和小片段DNA測序， 具有重 要的應用價值和意義。 權利要求書2頁 說明書15頁 序列表1頁 附圖11頁 CN 112110968 A 2020.12.22 CN 112110968 A 1.一種化合物， 其特征在于： 所述化合物為名稱為dNTPs-HCAP的聚集誘導熒光分子修 飾的核苷酸， 所述dNTPs-HCAP為dATP-HCAP、 dTTP-HCAP、 dCTP-HCAP或dGTP-HCAP； 其中， 所述 dATP-HCAP的結構式如式 所示， 。

4、所述dTTP-HCAP的結構式如式所示， 所述dCTP-HCAP的結 構式如式所示， 所述dGTP-HCAP的結構式如式所示： 2.權利要求1所述的化合物的制備方法， 其特征在于： 所述制備方法包括將dNTPs的 位磷酸根與名稱為HCAP的2-(3-(4-(二甲氨基)苯基)丙烯?；?磷酸的磷酸根進行共價連 接， 得到權利要求1所述的化合物； 其中， 所述dNTPs為dATP、 dTTP、 dCTP或dGTP， 對應所述 dNTPs-HCAP分別為dATP-HCAP、 dTTP-HCAP、 dCTP-HCAP、 dGTP-HCAP。 3.一種dNTPs的修飾物， 其特征在于： 所述修飾物為權利要。

5、求1中所述dNTPs-HCAP中任 兩種、 任三種或任四種。 4.權利要求1所述的化合物或權利要求3中所述的修飾物在檢測單核苷酸多態性和/或 DNA測序中的應用。 權利要求書 1/2 頁 2 CN 112110968 A 2 5.用于DNA測序的成套試劑， 其特征在于： 所述成套試劑包括權利要求1所述的化合物 或權利要求3中所述的修飾物和蝦堿性磷酸酶。 6.權利要求5所述的成套試劑在DNA測序中的應用。 7.用于檢測單核苷酸多態性的成套試劑， 其特征在于： 所述成套試劑包括權利要求1所 述的化合物或權利要求3中所述的修飾物、 鎖式探針和蝦堿性磷酸酶。 8.權利要求7所述的成套試劑在檢測單核苷酸。

6、多態性中的應用。 9.根據權利要求8所述的應用， 其特征在于： 所述檢測單核苷酸多態性是利用鎖式探 針-滾壞擴增反應檢測單核苷酸多態性。 10.一種試劑盒， 其特征在于： 所述試劑盒包括權利要求1所述的化合物， 或權利要求3 中所述的修飾物， 或權利要求5所述的成套試劑， 或權利要求7所述的成套試劑。 權利要求書 2/2 頁 3 CN 112110968 A 3 聚集誘導熒光分子修飾的核苷酸及其在DNA測序和SNPs檢測 中的應用 技術領域 0001 本發明涉及基因測序領域， 具體涉及聚集誘導熒光分子修飾的核苷酸及其在DNA 測序和SNPs檢測中的應用。 背景技術 0002 DNA測序技術在生。

7、物醫療領域具有重要意義。 其中， 邊合成邊測序法是一種快速、 高效的檢測方法， 例如454測序儀采用的焦磷酸測序法， 在四種酶的聯合作用下， 能進行邊 合成邊測序。 為簡化測序程序， 先后出現了以美國PacBio公司的單分子實時測序法為代表 的一些其他的邊合成邊測序法。 在DNA合成過程中， 使用的核苷酸通常分為兩種， 一種為普 通的天然核苷酸， 另一種為人工修飾的核苷酸， 如用熒光分子、 核苷酸或聚合物等修飾的核 苷酸可以用于DNA測序或一些靶標生物分子的檢測。 在DNA測序中， 天然核苷酸使用時需要 引入額外的反應來產生檢測信號， 操作步驟較繁瑣， 為使其更簡化， 有科學家提出將熒光標 記。

8、的核苷酸引入到DNA測序中， 該反應在DNA聚合酶和磷酸酶的作用下能產生實時熒光， 從 而可進行更快速、 靈敏度更高的測序。 因此， 熒光分子修飾的核苷酸在DNA測序方法研究中 具有重要意義。 0003 隨著熒光材料的發展， 唐本忠等人發現了一種聚集誘導熒光分子， 不同于普通熒 光分子的聚集淬滅現象， 該種分子在溶液狀態下不發光或發出弱熒光， 但在聚集態時發出 很強熒光(Hong,Yuning,Jacky WY Lam,and Ben Zhong Tang.Aggregation-induced emission:phenomenon,mechanism and applications.Ch。

9、emical Communications 29 (2009):4332-4353.)。 聚集誘導熒光分子在生物成像及檢測中具有獨特的潛力和優勢， 但 迄今為止還沒有將聚集誘導熒光分子應用于基于DNA擴增反應的單堿基核苷酸多態性檢測 和小片段DNA序列的檢測。 發明內容 0004 本發明所要解決的技術問題為如何準確地檢測單核苷酸多態性和小片段DNA序 列。 0005 為解決上述技術問題， 本發明首先提供了一種化合物。 0006 本發明所提供的化合物為名稱為dNTPs-HCAP的聚集誘導熒光分子修飾的核苷酸， 所述dNTPs-HCAP為dATP-HCAP、 dTTP-HCAP、 dCTP-HCA。

10、P或dGTP-HCAP； 其中， 所述dATP-HCAP的 結構式如式 所示， 所述dTTP-HCAP的結構式如式所示， 所述dCTP-HCAP的結構式如式所 示， 所述dGTP-HCAP的結構式如式所示： 說明書 1/15 頁 4 CN 112110968 A 4 0007 0008 本發明進一步提供了上述化合物的制備方法。 0009 本發明所提供的上述化合物的制備方法包括將dNTPs的位磷酸根與名稱為HCAP 的2-(3-(4-(二甲氨基)苯基)丙烯?；?磷酸的磷酸根進行共價連接， 得到上述化合物； 其 中， 所述dNTPs為dATP、 dTTP、 dCTP和dGTP， 對應所述dNTPs。

11、-HCAP為dATP-HCAP、 dTTP-HCAP、 dCTP-HCAP和dGTP-HCAP。 0010 上述化合物中全部、 任三種、 任兩種的dNTPs的修飾物也在本發明的保護范圍之 內。 0011 上述化合物或dNTPs的修飾物在檢測單核苷酸多態性(SNPs)和/或DNA測序中的應 用也在本發明的保護范圍之內。 0012 上述應用中， 所述檢測單核苷酸多態性為檢測是否存在單核苷酸多態性和/或檢 測單核苷酸多態性的堿基突變的類型。 0013 為解決上述技術問題， 本發明進一步提供了用于DNA測序的成套試劑。 0014 本發明所提供的用于DNA測序的成套試劑包括上述化合物(dNTPs-HCA。

12、P)或dNTPs 說明書 2/15 頁 5 CN 112110968 A 5 的修飾物和蝦堿性磷酸酶(rSAP)。 0015 上述用于DNA測序的成套試劑， 可以只由上述化合物或dNTPs的修飾物和蝦堿性磷 酸酶組成， 也可以包括其他組分。 0016 上述用于DNA測序的成套試劑的制備方法包括將dATP-HCAP、 dTTP-HCAP、 dCTP- HCAP、 dGTP-HCAP和蝦堿性磷酸酶分別進行單獨包裝的步驟。 0017 本發明所提供DNA測序的方法， 包括向擴增反應體系中加入上述化合物和蝦堿性 磷酸酶的步驟。 0018 在本發明具體的實施方式中， 所述DNA測序包括如下步驟： 在待測D。

13、NA一端加上接 頭得到待測模板， 將與接頭序列互補的引物修飾到磁珠上并與待測模板雜交后加入到擴增 反應體系中， 在擴增反應體系中逐次加入dNTPs-HCAP中一種檢測550nm處和640nm處熒光信 號(分別計為Fa1和Fb1)， 擴增反應完成后加入蝦堿性磷酸酶檢測550nm處和640nm處熒光信 號(分別計為Fa2和Fb2)， 根據550nm處和640nm處熒光信號變化(分別計為550nm和 640nm， 550nmFa2-Fa1， 640nmFb2-Fb1)確定待測DNA的待測堿基的信息； 0019 所述待測DNA的待測堿基的信息的判斷方法如下： 構建四種參照DNA， 所述參照DNA 的待。

14、測第一位堿基分別為A、 G、 C、 T， 且第二位與第一位堿基不相同； 在四種參照DNA一端加 上上述接頭得到四種參照模板， 將與接頭序列互補的引物修飾到磁珠上并與四種參照模板 分別雜交后加入到四個擴增反應體系中， 在每個擴增反應體系中逐次加入dNTPs-HCAP中一 種， 分別測定與參照DNA的待測第一位堿基互補配對時550nm和640nm熒光信號變化和 不互補配對時550nm和640nm空白熒光信號變化， 最終得到互補配對時A-H、 G-H、 C-H、 T- H的550nm和640nm的熒光信號變化和不互補配對時A-H、 G-H、 C-H、 T-H的550nm和 640nm的空白熒光信號變。

15、化范圍； 0020 若加入dNTPs-HCAP中一種檢測到的550nm和640nm熒光信號變化在所述空白 熒光信號變化范圍內， 則說明加入的dNTPs-HCAP對應的dNTPs的堿基與待測DNA上待測堿基 不互補配對； 若檢測到的550nm和640nm熒光信號變化不在所述空白熒光信號變化范圍 內且接近上述相應堿基互補配對時的550nm和640nm熒光信號變化， 則說明加入的 dNTPs-HCAP對應的dNTPs的堿基與待測DNA上待測堿基互補配對； 若檢測到550nm和 640nm熒光信號變化不在所述空白熒光信號變化范圍內且接近上述相應堿基互補配對時的 550nm和640nm熒光信號變化的N倍。

16、(N為大于等于1的自然數)， 則說明加入的dNTPs- HCAP對應的dNTPs的堿基與待測DNA上待測堿基及待測堿基的下N-1位互補配對， 從而確定 待測堿基的信息， 以此類推， 確定待測DNA中所有待測堿基的信息， 完成待測DNA的測序。 0021 為解決上述技術問題， 本發明還提供了用于檢測單核苷酸多態性的成套試劑。 0022 上述成套試劑中， 所述檢測單核苷酸多態性為檢測是否存在單核苷酸多態性和/ 或檢測單核苷酸多態性的堿基突變的類型。 0023 本發明所提供的用于檢測單核苷酸多態性的成套試劑， 包括上述化合物或dNTPs 的修飾物、 蝦堿性磷酸酶和鎖式探針。 0024 上述用于檢測單。

17、核苷酸多態性的成套試劑， 可以只由上述化合物(dNTPs-HCAP)或 dNTPs的修飾物、 蝦堿性磷酸酶(rSAP)和鎖式探針組成， 也可以包括其他組分。 0025 上述用于所述檢測單核苷酸多態性的成套試劑的制備方法包括將dATP-HCAP、 dTTP-HCAP、 dCTP-HCAP、 dGTP-HCAP、 rSAP和鎖式探針分別進行單獨包裝的步驟。 說明書 3/15 頁 6 CN 112110968 A 6 0026 本發明進一步提供了上述用于檢測單核苷酸多態性的成套試劑在檢測單核苷酸 多態性中的應用。 0027 上述應用中， 所述檢測單核苷酸多態性具體為利用滾環擴增反應檢測單核苷酸多 態。

18、性； 更具體的為利用鎖式探針-滾環擴增反應檢測單核苷酸多態性。 0028 上述應用中， 所述檢測單核苷酸多態性為檢測是否存在單核苷酸多態性和/或檢 測單核苷酸多態性的堿基突變的類型。 0029 本發明進一步還提供了一種試劑盒， 所述試劑盒包括上述化合物， 或dNTPs的修飾 物或上述用于DNA測序的成套試劑或上述用于檢測單核苷酸多態性的成套試劑。 0030 上述試劑盒為用于檢測單核苷酸多態性和/或用于DNA測序的試劑盒。 0031 上述試劑盒中， 所述檢測單核苷酸多態性為檢測是否存在單核苷酸多態性和/或 檢測單核苷酸多態性的堿基突變的類型。 0032 在本發明中， 檢測是否存在單核苷酸多態性的。

19、方法包括如下步驟： 0033 根據野生型靶標分子設計一條鎖式探針， 所述鎖式探針從3 端起第一位核苷酸與 野生型靶標分子的單核苷酸多態性位點互補， 從3 端起第二位開始后的一段序列與野生型 靶標分子的單核苷酸多態性位點的下游序列反向互補配對， 所述鎖式探針的5 端的一段序 列與野生型靶標分子的單核苷酸多態性位點的上游序列互補配對； 根據鎖式探針設計一條 與鎖式探針特異性結合的引物； 0034 分別利用野生型靶標分子和突變型靶標分子誘導鎖式探針進行成環反應后加入 到滾環擴增反應體系中， 將滾環擴增反應體系中dNTPs中一種替換為相應的dNTPs-HCAP檢 測640nm處熒光信號(計為F1)， 。

20、利用引物進行滾環擴增反應， 完成后加入蝦堿性磷酸酶檢測 640nm處熒光信號(計為F2)， 根據640nm處熒光信號變化(計為640nm， 640nmF2-F1)確 定是否存在單核苷酸多態性， 所述是否存在單核苷酸多態性的判斷方法如下： 如果野生型 靶標分子滾環擴增反應前后在640nm處有熒光信號變化， 而突變型靶標分子滾環擴增反應 前后在640nm處無熒光信號變化， 那么說明發生單堿基突變， 即存在SNPs； 如果野生型靶標 分子和突變型靶標分子滾環擴增反應前后在640nm處均有熒光信號變化， 那么說明沒有發 生單堿基突變， 即不存在SNPs。 0035 本發明中檢測單核苷酸多態性的堿基突變。

21、的類型， 需要完成上述檢測是否存在單 核苷酸多態性后， 另外設計三種鎖式探針， 三種鎖式探針上相應位置堿基與上述檢測是否 存在單核苷酸多態性中的鎖式探針的堿基互不相同， 根據上述檢測是否存在單核苷酸多態 性的方法先利用突變型靶標分子誘導鎖式探針進行成環反應進行滾環擴增反應， 如果滾環 擴增反應前后在640nm處有熒光信號變化則說明突變型靶標分子的突變堿基與該鎖式探針 上堿基互補配對， 確定單核苷酸多態性的堿基突變的類型； 如果滾環擴增反應前后在640nm 處無熒光信號變化， 則說明突變型靶標分子的突變堿基與該鎖式探針上堿基不互補配對。 0036 本發明利用具有雙重熒光信號的聚集誘導熒光分子合成。

22、了聚集誘導熒光分子標 記的核苷酸(dNTPs-HCAP)， 并將其引入到擴增反應體系中， 通過擴增反應前后加入蝦堿性 磷酸酶并檢測加入蝦堿性磷酸酶前后的熒光信號變化， 可用于檢測單核苷酸多態性和小片 段DNA測序。 另外， 雙重熒光信號的檢測使得邊合成邊測序方法更準確、 簡便， 具有重要的應 用價值和意義。 說明書 4/15 頁 7 CN 112110968 A 7 附圖說明 0037 圖1為HCA的1H NMR圖。 0038 圖2為HCA的13C NMR圖。 0039 圖3為HCA質譜圖。 0040 圖4為HCAPE的1H NMR圖。 0041 圖5為HCAPE的13C NMR圖。 0042。

23、 圖6為HCAPE的31P NMR圖。 0043 圖7為HCAPE質譜圖。 0044 圖8為HCAP的1H NMR圖。 0045 圖9為HCAP的13C NMR圖。 0046 圖10為HCAP的31P NMR圖。 0047 圖11為HCAP質譜圖。 0048 圖12為HCAP水溶液在蝦堿性磷酸酶作用前(HCAP)后(HCA)的熒光激發光譜(Ex)和 熒光發射光譜(Em)。 0049 圖13為dNTPs-HCAP的質譜圖； 其中， A： dATP-HCAP(A-H)質譜圖； B： dTTP-HCAP(T-H) 質譜圖； C： dCTP-HCAP(C-H)質譜圖； D： dGTP-HCAP(G-H。

24、)質譜圖。 0050 圖14為紫外-可見吸收光譜； 其中， A： dATP、 HCAP、 A-H； B： dGTP、 HCAP、 G-H； C： dCTP、 HCAP、 C-H； D： dTTP、 HCAP、 T-H。 0051 圖15為熒光發射光譜圖； 其中， A： rSAP作用前； B： rSAP作用后。 0052 圖16為dNTP-HCAP用于RCA反應監測SNPs； 其中， A： 反應機理圖； B： DNA聚合酶篩選； C： 一種或四種混合dNTPs-HCAP用于RCA反應中； D： RCA反應過程瓊脂糖凝膠電泳分析； E、 四 種dNTP-HCAP分別用于檢測WT和MT的結果； F、。

25、 dATP-HCAP用于檢測四種不同濃度的WT和MT時 640nm熒光信號。 0053 圖17為dNTPs-HCAP對小片段DNA的測序的機理及程序。 0054 圖18為dNTPs-HCAP用于小片段DNA的測序； 其中， A： 測序片段及引物序列； B： 測序 過程中550nm和640nm熒光信號變化。 正置柱狀圖為640nm， 倒置柱狀圖為550nm。 具體實施方式 0055 下面結合具體實施方式對本發明進行進一步的詳細描述， 給出的實施例僅為了闡 明本發明， 而不是為了限制本發明的范圍。 以下提供的實施例可作為本技術領域普通技術 人員進行進一步改進的指南， 并不以任何方式構成對本發明的限。

26、制。 0056 下述實施例中的實驗方法， 如無特殊說明， 均為常規方法。 下述實施例中所用的材 料、 試劑等， 如無特殊說明， 均可從商業途徑得到。 0057 本發明下述實施例中用到的溶液的組分及配比： 0058 緩沖液1： 10mM Tris-HCl,1mM MnCl2,40mM NH4Cl,100mM KCl,pH 7.5， 溶劑為水。 0059 緩沖液2： 100mM phosphate buffer,100mM NaCl,pH 7.3， 溶劑為水。 0060 洗滌液1： 10mM Tris-HCl,1mM MnCl2,40mM NH4Cl,100mM KCl,0.05Tween 20,。

27、pH 7.5， 溶劑為水。 0061 洗滌液2： 100mM phosphate buffer,100mM NaCl,0.05Tween 20,pH 7.3， 溶劑 說明書 5/15 頁 8 CN 112110968 A 8 為水。 0062 本發明下述實施例中瓊脂糖凝膠電泳方法如下： 0063 稱取1.25g瓊脂糖溶于25mL TAE(2mol/L三羥甲基氨基甲烷-醋酸； 100mmol/L乙二 胺四乙酸鈉)電泳液中， 微波爐加熱3min后， 加入2.5 L10000 x SYBR gold DNA染料， 混勻后 加入凝膠模具中， 制備5瓊脂糖凝膠。 樣品溶液中加入上樣緩沖液混勻， 加入到凝。

28、膠孔中， 設置電壓120V， 時間50min， 進行凝膠電泳。 0064 實施例1 聚集誘導熒光分子HCAP的合成 0065 一、 4-二甲氨基-2 -羥基查爾酮(4-Dimethylamino-2 -hydroxychalcone， HCA)合 成 0066 稱取4-二甲氨基苯甲醛(12mmol,1.79g)與2-羥基苯乙酮(13.2mmol,1.80g)于 100mL圓底燒瓶中， 加入30mL乙醇攪拌使其溶解。 稱取KOH(2.8g,50mmol)溶于2mL水中， 然后 加入到圓底燒瓶中， 室溫攪拌24小時。 反應結束后， 用稀鹽酸調節反應體系pH至7.0， 抽濾并 用乙醇洗滌3次沉淀物，。

29、 將濾餅烘干。 烘干后的濾餅溶解于二氯甲烷中， 抽濾并用二氯甲烷 洗滌3次， 收集濾液， 減壓旋蒸得到的產物采用質子核磁共振譜(1H NMR)、 質子核磁共振譜 (13C NMR)、 高分辨質譜進行鑒定， 1H NMR圖如圖1、13C NMR圖如圖2和質譜圖如圖3所示。1H NMR(400MHz， CDCl3)數據為： (TMS， ppm)7.94-7.88(m， 2H)， 7.59-7.53(d， 2H)， 7.49-7.41 (m， 2H)， 7.02-6.97(m， 1H)， 6.94-6.88(t， 1H)， 6.72-6.66(d， 2H)， 符合HCA分子的H原子信 息。 13C 。

30、NMR(100MHz， CDCl3)數據為： 193.55， 163.54， 152.38， 146.61， 135.73， 130.94， 129.45， 122.47， 120.47， 118.66， 118.56， 114.38， 111.93， 39.98， 符合HCA分子中C原子信 息。 質譜數據： HCA的分子式為C17H17NO2(M)， 計算分子量為267.1293(M)， 測定分子量為 268.2500(M+H)， 符合HCA分子的分子量。 因此確定了得到的產物為HCA， 結構式如下： 0067 0068 二、 2-(3-(4-(二甲氨基)苯基)丙烯?；?磷酸二乙酯(2-(3。

31、-(4-(Dimethylamino) phenyl)acryloyl)phenyl Diethyl Phosphate， HCAPE)合成 0069 稱取HCA(1mmol,267mg)和NaH(2mmol,80mg)于100mL兩口瓶中， 加入20mL超干四氫 呋喃(THF)使其充分溶解， 氮氣保護條件下逐滴加入氯磷酸二乙酯(POCl(OEt)2)(2.0mmol, 0.3mL)， 室溫攪拌2小時。 反應結束后加入2mL水猝滅反應。 將反應產物減壓旋干， 粗產物用 乙酸乙酯和水萃取3次， 收集上層有機相并用無水硫酸鎂干燥， 減壓旋蒸得到粗產物。 粗產 物進行柱層析薄層色譜分離， 展開劑為石。

32、油醚與乙酸乙酯(5:1)， 收集產物點， 減壓旋蒸得 到的橙黃色油狀產物采用核磁共振氫譜(1H NMR)、 核磁共振碳譜(13C NMR)、 核磁共振磷譜 (31P NMR)、 高分辨質譜進行鑒定， 1H NMR圖如圖4、13C NMR圖如圖5、31P NMR圖如圖6和質譜 圖如圖7所示， 1H NMR(400MHz， DMSO-D6)數據為： (TMS， ppm)7.59-7.43(m,6H)， 7.36-7.30 (t， 1H)， 7.13-7.06(d， 1H)， 6.72-6.66(d， 2H)， 4.13-4.04(m， 4H)， 2.98-2.93(s， 6H)， 1.19- 1.。

33、14(m， 6H)， 除去其中未除干凈的二氯甲烷的H原子， 其它均符合HCAPE分子的H原子信息符 合HCAPE分子的H原子信息。 13C NMR(100MHz， DMSO-D6)數據為： 191.28， 152.57， 148.10， 146.38， 133.09， 132.43， 131.08， 130.23， 125.62， 121.94， 121.23， 120.88， 112.24， 64.99， 16.26， 除去其中未除干凈的二氯甲烷的C原子， 其它均符合HCAPE分子的C原子信息。 31P NMR 說明書 6/15 頁 9 CN 112110968 A 9 (162MHz,DM。

34、SO-D6)數據為： -6.26。 質譜數據： HCAPE的分子式為C17H17NO2(M)， 計算分子量為 403.1582(M)， 測定分子量為404.1667(M+H)， 符合HCAPE分子的分子量。 因此確定了得到的 產物為HCAPE， 結構式如下： 0070 0071 三、 2-(3-(4-(二甲氨基)苯基)丙烯?；?磷酸(2-(3-(4-(Dimethylamino) phenyl)acryloyl)phenyl Phosphate， HCAP)合成 0072 稱取HCAPE(0.5mmol,201mg)于100mL兩口瓶中， 加入25mL超干二氯甲烷(DCM)使其 充分溶解， 在。

35、0、 氮氣保護條件下， 逐滴加入三甲基碘硅烷(TMS-I)(2mmol,0.28mL)。 室溫 攪拌3小時。 反應結束后， 加入2mL甲醇攪拌0.5小時終止反應。 產物減壓旋蒸， 得到粗產物。 粗產物進行柱層析薄層色譜分離， 展開劑為甲醇與乙酸乙酯(10:1)， 收集產物點， 減壓旋蒸 得到的橙黃色油狀產物采用核磁共振氫譜(1H NMR)、 核磁共振碳譜(13C NMR)、 核磁共振磷 譜(31P NMR)、 高分辨質譜進行鑒定， 1H NMR圖如圖8、13C NMR圖如圖9、31P NMR圖如圖10和質 譜圖如圖11所示， 1H NMR(400MHz， CDCl3)數據為： (TMS,ppm。

36、)7.75-7.66(d,2H)， 7.61-7.50 (m,4H)， 7.38-7.25(m， 2H)， 7.18-7.07(d,2H)， 除去其中未除干凈的甲醇的H原子， 其余均符 合HCAP分子的H原子信息。 13C NMR(100MHz,DMSO-D6)數據為： 190.99， 149.50， 143.82， 132.39， 130.55， 129.83， 124.21， 120.83， 114.80， 41.70， 除去其中未除干凈的甲醇的C原 子， 其余均符合HCAP分子的C原子信息。 31P NMR(162MHz,DMSO-D6)數據為： -6.00。 質譜數據： HCAP的分子。

37、式為C17H18NO5(M)， 計算分子量為347.0923(M)， 測定分子量為346.8333(M-H)， 符 合HCAP分子的分子量。 因此確定了得到的產物為HCAP， 結構式如下: 0073 0074 HCAP水溶液加入蝦堿性磷酸酶(rSAP)， 在rSAP作用下HCAP與rSAP反應得到了HCA， 檢測加入rSAP前后的熒光激發和熒光發射光譜如圖12， 結果顯示rSAP作用后， HCAP綠色熒 光降低(550nm)， 紅色熒光增強(640nm)。 0075 實施例2： 聚集誘導熒光分子修飾的核苷酸(dNTPs-HCAP)的合成 0076 本實施例中聚集誘導熒光分子修飾的核苷酸(dNT。

38、Ps-HCAP)包括聚集誘導熒光分 子修飾核苷酸dATP-HCAP(A-H)、 dTTP-HCAP(T-H)、 dCTP-HCAP(C-H)和dGTP-HCAP(G-H)， 合成 步驟相同， 以dATP-HCAP(A-H)為例進行詳細說明： 0077 dATP(12.5 mol,125 L)用BioRad AG-50w-XB離子交換柱酸化， 然后向該溶液中加 入等物質的量三正丁胺(12.5umol,3.0 L)室溫攪拌5分鐘。 減壓旋蒸除去其中的水， 再用 2mL超干N,N-二甲基甲酰胺(DMF)旋干兩次， 然后溶于0.5mL DMF中。 在氮氣保護下， 向該DMF 溶液中加入溶于0.5mL 。

39、DMF的1,1 -羧基二咪唑(63 mol,10.1mg)， 室溫攪拌12小時。 反應結 束后加入3.2 L無水甲醇反應0.5小時。 將合成的HCAP溶于DMF溶劑中配成100mmol溶液， 并 加入等物質的量三正丁胺使其成鹽。 取該染料溶液0.25mL加入到上述反應體系中， 并同時 說明書 7/15 頁 10 CN 112110968 A 10 加入溶于0.5ml DMF的無水溴化鎂(136 mol,25mg)， 室溫攪拌30小時， 整個反應均在氮氣保 護下進行。 反應結束后， 減壓旋干， 并將產物溶于2mL水中得到粗產物。 將粗產物用Hi-Trap Q-HP(5mL)陽離子交換柱純化， 純。

40、化時先用去離子水再用50mmol/L哌嗪-1,4-二乙磺酸/ (1mol/L氯化鈉)緩沖液沖柱。 收集產物， 加入蝦堿性磷酸酶(10U,10 L)37攪拌0.5小時， 水解未反應的HCAP和dATP。 反應結束后， 用0.22 m水相濾頭過濾， 濾液用高效液相色譜分離 并收集連接產物。 洗脫劑為A(50mmol/L醋酸三乙胺,pH 7.0)和B(乙腈)， 洗脫梯度為： 0- 6min： A(85)， B(15)； 6-20min： A(8580.8)， B(1519.2)； 10-15min： A (80.8)， B(19.2)。 收集得到的連接產物減壓旋干后利用質譜檢測， 結果如圖13中A所。

41、 示， ESI-MS(A-H,m/z):calcd.for C27H32N6O16P4:820.0825(M),found 819.0000(M-H)， 確定 得到的產物為dATP-HCAP， 結構式如式 所示， -20備用。 dATP-HCAP進行紫外-可見吸收光 譜檢測， 結果如圖14中A所示， 最大紫外-可見吸收峰為262nm和427nm。 0078 0079 dTTP-HCAP的合成步驟同dATP-HCAP， 區別在于將dATP分別替換為dTTP。 收集得到 的連接產物減壓旋干后利用質譜檢測， 結果如圖13中B所示， ESI-MS(T-H,m/z):calcd.for C27H33N3。

42、O18P4:811.0710(M),found 809.8333(M-H)， 確定得到的產物為dTTP-HCAP， 結構式如 式所示， -20備用。 dTTP-HCAP進行紫外-可見吸收光譜檢測， 結果如圖14中B所示， 最大 紫外-可見吸收峰為267nm和427nm。 0080 0081 dCTP-HCAP的合成步驟同dATP-HCAP， 區別在于將dATP分別替換為dCTP。 收集得到 的連接產物減壓旋干后利用質譜檢測， 結果如圖13中C所示， ESI-MS(C-H,m/z):calcd.for C26H32N4O17P4:796.0713(M),found 795.4167(M-H),8。

43、17.4167(M-2H+Na),839.4167(M-3H+ 2Na),851.4167(M-3H+3Na)， 確定得到的產物為dCTP-HCAP， 結構式如式所示， -20備用。 dCTP-HCAP進行紫外-可見吸收光譜檢測， 結果如圖14中C所示， 最大紫外-可見吸收峰為 266nm和427nm。 0082 說明書 8/15 頁 11 CN 112110968 A 11 0083 dGTP-HCAP的合成步驟同dATP-HCAP， 區別在于將dATP分別替換為dGTP。 收集得到 的連接產物減壓旋干后利用質譜檢測， 結果如圖13中D所示， ESI-MS(G-H,m/z):calcd.fo。

44、r C27H32N6O17P4:836.0774(M),found 835.2500(M-H)， 確定得到的產物為dGTP-HCAP， 結構式如 式所示， -20備用。 dGTP-HCAP進行紫外-可見吸收光譜檢測， 結果如圖14中D所示， 最大 紫外-可見吸收峰為255nm和427nm。 0084 0085 dATP-HCAP、 dTTP-HCAP、 dCTP-HCAP和dGTP-HCAP及HCAP在rSAP作用前后熒光如圖 15所示， dNTPs-HCAP在rSAP作用下550nm和640nm均無熒光變化， 而HCAP在rSAP作用下發生 聚集， 550nm黃綠色熒光減弱且出現640nm紅。

45、色熒光。 0086 實施例3 dNTPs-HCAP用于滾環擴增反應檢測SNPs 0087 dNTPs-HCAP用于滾環擴增反應檢測SNPs原理如圖16中A所示， 當野生型靶標分子 與鎖式探針Lock完全互補配對時， Lock可以被T4連接酶環化成圓環形DNA。 然后引物 primer2開始進行滾環擴增反應。 在擴增反應中， dNTPs-HCAP上的HCAP分子在DNA聚合酶作 用下脫落， 在蝦堿性磷酸酶的作用下磷酸根被水解形成HCA， 發出640nm紅色熒光。 而突變型 靶標分子不能與Lock完全互補配對， 因此在T4連接酶作用下不能環化， 所以不能進行后續 的滾環擴增反應， 因此無640nm。

46、紅色熒光出現。 因此， 根據640nm處熒光信號變化(640nm) 可以判斷靶標分子是否發生單堿基突變。 0088 基于上述原理和下述滾環擴增反應體系的篩選， dNTPs-HCAP用于滾環擴增反應檢 測是否存在SNPs的方法包括如下步驟： 0089 1)根據野生型靶標分子， 設計一條具有6090堿基長的鎖式探針Lock， 所述鎖式 探針Lock從3 端起第一位核苷酸與野生型靶標分子的單核苷酸多態性位點互補， 從3 端起 第二位開始后的一段序列與野生型靶標分子的單核苷酸多態性位點的下游序列反向互補 配對， 所述鎖式探針Lock的5 端的一段序列與野生型靶標分子的單核苷酸多態性位點的上 游序列互補。

47、配對， GC含量為25.860.6。 用NUPACK軟件預測Lock的二級結構， 改變A、 T、 C、 G四種核苷酸的組成， 使該鏈沒有二級結構從而可以順利進行RCA反應。 0090 2)根據鎖式探針Lock的序列設計引物(primer)， 引物(primer)能與鎖式探針Lock 特異性結合， 以實現擴增反應。 0091 3)100nM鎖式探針Lock分別與野生型靶標分子(WT)和突變型靶標分子(MT)混合均 勻95加熱5分鐘然后緩慢降至室溫， 得到的產物分別命名為Lock/WT和Lock/MT。 0092 4)在50 L反應體系中加入DNA連接緩沖液、 100nM Lock/WT或Lock。

48、/MT和10U T4DNA 連接酶， 37孵育60分鐘后再65加熱10分鐘使T4DNA連接酶失活， 分別得到Lock/WT環化 反應后的體系和Lock/MT環化反應后的體系。 0093 5)在Lock/WT環化反應后的體系和Lock/MT環化反應后的體系分別加入100nM引物 (primer)， 37孵育1小時， 得到Lock/WT/primer和Lock/MT/primer。 0094 6)在Lock/WT/primer和Lock/MT/primer中分別加入200 M dATP-HCAP、 dTTP、 dCTP 說明書 9/15 頁 12 CN 112110968 A 12 和dGTP、 。

49、0.2U/ L Bst DNA聚合酶和5 L 10 x緩沖液1， 加入去離子水至總體積為50 L， 混勻 后檢測640nm處熒光信號(記為F1)， 65加熱60分鐘后加入1U rSAP混勻后檢測640nm處熒 光信號(記為F2)， 激發波長為427nm。 檢測640nm處熒光信號變化記為640nm(640nm F2-F1)。 根據640nm處熒光信號變化(計為640nm， 640nmF2-F1)確定是否存在單核苷 酸多態性， 所述是否存在單核苷酸多態性的判斷方法如下： 0095 如果野生型靶標分子滾環擴增反應前后在640nm處有熒光信號變化(640nm)， 而 突變型靶標分子滾環擴增反應前后在。

50、640nm處無熒光信號變化， 那么說明發生單堿基突變， 即存在SNPs。 0096 dNTPs-HCAP用于滾環擴增反應檢測是單核苷酸多態性的堿基突變的類型包括： 需 要完成上述檢測是否存在單核苷酸多態性后， 另外設計三種鎖式探針， 三種鎖式探針上相 應位置堿基與上述檢測是否存在單核苷酸多態性中的鎖式探針的堿基互不相同， 根據上述 檢測是否存在單核苷酸多態性的方法先利用突變型靶標分子誘導鎖式探針進行成環反應 進行滾環擴增反應， 如果滾環擴增反應前后在640nm處有熒光信號變化則說明突變型靶標 分子的突變堿基與該鎖式探針上堿基互補配對， 確定單核苷酸多態性的堿基突變的類型； 如果滾環擴增反應前后。