一株用于果酒全過程綠色生產的東方伊薩酵母及其應用.pdf

《一株用于果酒全過程綠色生產的東方伊薩酵母及其應用.pdf》由會員分享，可在線閱讀，更多相關《一株用于果酒全過程綠色生產的東方伊薩酵母及其應用.pdf（18頁完成版）》請在專利查詢網上搜索。

1、(19)中華人民共和國國家知識產權局 (12)發明專利申請 (10)申請公布號 (43)申請公布日 (21)申請號 202010525940.8 (22)申請日 2020.06.10 (83)生物保藏信息 CGMCC No. 19724 2020.04.24 (71)申請人 南京萬拓生物科技有限公司 地址 210000 江蘇省南京市江北新區長蘆 街道寧六路606號D棟1401室 (72)發明人 王友升 (74)專利代理機構 北京易捷勝知識產權代理事 務所(普通合伙) 11613 代理人 齊勝杰岑海梅 (51)Int.Cl. C12N 1/16(2006.01) C12G 3/024(2019.。

2、01) A23B 7/155(2006.01) C12R 1/645(2006.01) C12R 1/865(2006.01) (54)發明名稱 一株用于果酒全過程綠色生產的東方伊薩 酵母及其應用 (57)摘要 本 發 明 涉 及 一 株 東 方 伊 薩 酵 母 (Issatchenkiaorientalis)， 其于2020年04月 24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普 通微生物中心， 保藏號為CGMCCNo.19724， 命名 為IssatchenkiaorientalisWTB20042304。 該 菌株能有效利用檸檬酸和酒石酸， 對果酒中的檸 檬酸、 乳酸、 甲酸、 和琥珀酸都有。

3、降解能力， 對檸 檬酸的降解能力尤為顯著； 能有效提高總酚、 總 黃酮和花青素等活性物含量， 提升果酒抗氧化水 平。 此外， 該菌株對灰葡萄孢菌具有一定的抑制 作用。 因而該菌株可應用于水果采后貯藏保鮮或 果酒降酸發酵， 是一株用于果酒全過程綠色生產 的優選菌株。 權利要求書1頁 說明書15頁 附圖1頁 CN 112111416 A 2020.12.22 CN 112111416 A 1.一株東方伊薩酵母(Issatchenkia orientalis)， 其于2020年04月24日保藏于中國 微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心， 保藏號為CGMCC No .19724， 命名為 Issa。

4、tchenkia orientalis WTB20042304。 2.根據權利要求1所述的東方伊薩酵母I.orientalis WTB20042304在水果采后貯藏保 鮮或果酒降酸中的應用。 3.根據權利要求2所述的應用， 其特征在于： 所述水果為藍莓， 所述果酒為藍莓果酒。 4.一株鮮果保鮮方法， 其特征在于： 將東方伊薩酵母I.orientalis WTB20042304配成 菌懸液， 利用該菌懸液對鮮果進行噴灑或浸涂。 5.根據權利要求4所述的鮮果保鮮方法， 其特征在于： 將東方伊薩酵母I.orientalis WTB20042304活化， 用YPD液體培養基發酵培養， 離心得到菌體， 。

5、配制成濃度為1106CFU/mL 1108CFU/mL的菌懸液； 將水果放入菌懸液中， 浸泡30秒后取出， 風干； 放入保鮮盒中， 密 封后， 常溫貯藏。 6.根據權利要求4或5所述的鮮果保鮮方法， 其特征在于： 所述鮮果為葡萄或藍莓。 7.一株果酒降酸發酵方法， 是在向果汁中接種釀酒酵母之前， 先接種東方伊薩酵母 I.orientalis WTB20042304， 再進行發酵處理。 8.根據權利要求7所述的果酒降酸發酵方法， 其特征在于： 所述果酒為藍莓果酒， 所述 果汁為藍莓果汁。 9.根據權利要求7所述的果酒降酸發酵方法， 其特征在于： 新鮮藍莓破碎后， 經成分調 整得到藍莓果汁， 向所。

6、述藍莓果汁中加入東方伊薩酵母I.orientalis WTB20042304， 2-4天 后加釀酒酵母， 再進行糖度調節、 初發酵、 過濾和后發酵工藝流程。 10.根據權利要求7所述的果酒降酸發酵方法， 其特征在于： 所述東方伊薩酵母 I.orientalis WTB20042304的加菌量為1106CFU/mL。 權利要求書 1/1 頁 2 CN 112111416 A 2 一株用于果酒全過程綠色生產的東方伊薩酵母及其應用 技術領域 0001 本發明涉及一株功能酵母菌， 尤其涉及一株用于果酒全過程綠色生產的東方伊薩 酵母及其應用。 背景技術 0002 果酒是酵母菌利用水果本身的糖分發酵成為酒。

7、精的酒， 含有水果的特定風味和營 養成分， 是人類最早學會釀造的酒。 可釀造果酒的水果五花八門， 以獼猴桃、 楊梅、 橙、 葡萄、 藍莓、 紅棗、 櫻桃、 荔枝、 蜜桃、 柿子、 草莓等較為理想。 在果酒中， 最出名的要數葡萄酒， 近幾 年又因藍莓含有豐富的花青素可對抗自由基、 具有延緩衰老的功能而深受人們喜愛。 0003 果酒的釀制工藝為： 采摘鮮果分選破碎、 除梗果漿分離取汁澄清清 汁發酵倒桶貯酒過濾冷處理調配過濾成品。 原料品種是保證果酒產品質 量的重要因素之一， 它將直接影響果酒釀制后的感觀特性。 其中， 從采摘的鮮果中選取的水 果要求水果成熟度達到全熟透、 果汁糖分含量高且無霉爛變質。

8、、 無病蟲害。 而釀制后的成品 果酒中， 含酸量如果適當， 酒的滋味就醇厚、 協調、 適口。 反之適口性差、 酸味過重、 酒汁失光 渾濁， 降低消費者的購買欲。 果酒中的酸一部分是由原料帶來的， 如葡萄中的酒石酸， 蘋果 中的蘋果酸， 楊梅中的檸檬酸等； 也有發酵過程中產生的(酵母菌代謝物)， 如醋酸， 丁酸， 乳 酸， 琥珀酸等。 L-蘋果酸和酒石酸是葡萄酒中最突出的有機酸， 在葡萄酒釀造過程中起著至 關重要的作用， 包括葡萄酒的感官品質和物理， 生物化學和微生物穩定性。 果酒產品質量指 標中有一項就是要控制果酒中有機酸的總量。 0004 綜上所述， 在果酒的釀制工藝中， 鮮果的防腐保藏和成。

9、品酒中有機酸總量的控制 是影響果酒成本和質量的兩個重要環節。 0005 據分析， 新鮮果蔬品質劣變受諸多因素的影響， 但病害是最主要的原因。 其中， 真 菌性病害引起的腐爛變質是果實采后損失中最嚴重的因素， 不同水果的主要病害也不同， 葡萄主要由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)引起黑粉病， 蘋果主要由擴展青霉 (Penicillium expansum)引起青霉病。 目前， 解決鮮果防腐的常見和主要的方法是物理防 治和化學藥劑防治， 使用化學農藥不但導致病原菌產生耐藥性而降低殺菌效果， 同時因處 理不干凈造成的化學藥劑殘留也會影響到人們的健康。 而物理防治方法(如低溫儲藏)需要 。

10、借助專門的設備、 且往往需要耗能， 同時也不利于保留鮮果中營養成分。 而對果酒中有機酸 總量的控制， 現有技術通常是在果酒中加入降酸劑(可食用的堿)、 陰離子交換樹脂柱子降 酸、 低溫冷凍降酸等， 前一株降酸方式因引入堿影響果酒的風味和口感， 后一株降酸方式只 能影響在生產的過程中對有機酸進行控制且成本高效率低， 灌裝完成后無法對酒中有機酸 進行控制。 0006 生物降酸法， 是一株比較新的方法， 其利用微生物代謝途徑將果酒中的有機酸分 解以達到降酸目的， 相比物理和化學降酸， 生物降酸， 不僅能夠降低果酒的酸度， 更重要的 是可以增加果酒的穩定性,提升酒的品質， 副作用較小,目前研究較多的是。

11、蘋果酸-乳酸發 酵(malolactic fermentation， MLF)， 是由乳酸菌進行發酵。 乳酸菌會產生蘋果酸-乳酸酶， 說明書 1/15 頁 3 CN 112111416 A 3 L-蘋果酸在該酶的催化作用下變成L-乳酸和二氧化碳， 相對于蘋果酸來說， 乳酸較為柔和， 因此達到降酸作用。 但乳酸也是有機酸， 因而該方法實際上并不能有效降低果酒中的有機 酸和改善果酒口感。 發明內容 0007 (一)要解決的技術問題 0008 為了解決現有技術的上述問題， 本發明提供一株用于果酒全過程綠色生產的東方 伊薩酵母及其應用。 該菌株不僅具有生防效果， 對水果采后病原真菌具有抑制作用， 可以。

12、代 替化學殺菌劑防治水果采后病害， 保持水果新鮮防止腐爛變質； 同時該菌株還有優異的降 低果酒中檸檬酸、 乳酸、 甲酸和乙酸等有機酸的功能， 可用于果酒的發酵降酸。 尤其是當果 酒為藍莓果酒時， 所述菌株還能顯著提高藍莓果酒中花青素含量， 且幾乎能夠完全降解掉 藍莓果酒中的檸檬酸。 0009 (二)技術方案 0010 為了達到上述目的， 本發明采用的主要技術方案包括： 0011 申請人采用WL營養瓊脂培養基對自然發酵的藍莓果酒中微生物進行篩選和純化， 得到可有效利用檸檬酸、 酒石酸的且其降酸能力對酒精濃度不敏感的菌株， 通過鑒定， 確認 該菌株為東方伊薩酵母(I.orientalis)， 將其。

13、分類命名為I.orientalis WTB20042304， 并 于2020年04月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心， 保藏號為 CGMCC No.19724。 0012 基于本發明篩選的酵母菌株， 本發明還提供如下的技術方案： 0013 本發明還涉及上述東方伊薩酵母菌株I.orientalis WTB20042304在水果采后貯 藏保鮮或果酒降酸中的應用。 具體包括： 0014 方案一： 一株鮮果保鮮方法， 是將東方伊薩酵母I.orientalis WTB20042304配制 成菌懸液， 利用該菌懸液對鮮果進行噴灑或浸涂。 0015 具體方法為： 將東方伊薩酵母I.or。

14、ientalis WTB20042304活化， 用YPD液體培養基 發酵培養， 離心得到菌體， 將菌體用無菌水清洗去除培養基后配制成濃度為1106CFU/mL 1108CFU/mL的菌懸液； 將水果放入菌懸液中， 浸泡30秒后取出， 風干； 放入保鮮盒中， 密 封后， 放入常溫貯藏。 0016 優選地， 所述鮮果為葡萄或藍莓。 0017 優選地， 所述活化步驟為： 取固體培養基上的單菌落于YPD液體培養基， 于26、 200r/min條件下培養24h， 4000rpm離心5min收集菌體， 用無菌水洗3遍。 0018 方案二： 一株果酒降酸發酵方法， 是在向果汁中接種釀酒酵母之前， 先接種東方。

15、伊 薩酵母I.orientalis WTB20042304， 然后進行發酵處理。 0019 優選地， 所述果酒為藍莓果酒， 所述果汁為藍莓果汁。 0020 優選地， 所述方法為： 由新鮮藍莓破碎后， 再經成分調整得到藍莓果汁， 向所述藍 莓果汁中加入東方伊薩酵母I.orientalis WTB20042304， 2-4天后加釀酒酵母， 經糖度調 節、 初發酵、 過濾、 后發酵制得。 延遲加入釀酒酵母目的是使先加入的東方伊薩酵母 I.orientalis WTB20042304能夠大量成活， 同時可先行降解果汁中自帶的有機酸， 如檸檬 酸、 蘋果酸等。 糖后加入， 避免因東方伊薩酵母I.orie。

16、ntalis WTB20042304優先利用糖而失 說明書 2/15 頁 4 CN 112111416 A 4 去降酸作用。 0021 優選地， 所述東方伊薩酵母I.orientalis WTB20042304的加菌量為1106CFU/ mL。 0022 優選地， 所述釀酒酵母的加菌量為1106CFU/mL， 糖度調節的加糖量為120g/L， 發 酵在22-26的室溫環境下進行發酵， 每天攪拌2次， 待發酵結束后過濾， 濾液為藍莓果酒。 0023 所述東方伊薩酵母I.orientalis WTB20042304在使用前， 包括一個活化處理： 取 固體培養基上的單菌落于YPD液體培養基， 于26。

17、、 200r/min條件下培養24h， 4000rpm離心 5min收集菌體， 用無菌水洗3遍。 0024 (三)有益效果 0025 本發明的有益效果是： 0026 (1)本發明篩選的東方伊薩酵母I.orientalis WTB20042304， 在檸檬酸(檸檬酸為 唯一碳源)篩選培養基上培養96h后培養基中檸檬酸的含量下降了92.39， 說明其能夠利 用檸檬酸； 在酒石酸(酒石酸為唯一碳源)篩選培養基上培養96h后培養基中酒石酸的含量 下降了38.84， 說明其能夠利用酒石酸。 將其加入到藍莓果汁中進行發酵， 在發酵終點時 未檢測到檸檬酸， 說明該菌株具有很強的檸檬酸降解能力。 此外， 若以。

18、僅加入了釀酒酵母的 藍莓汁發酵液為對照， 同時加入釀酒酵母和東方伊薩酵母I.orientalis WTB20042304的藍 莓汁發酵液， 在發酵終點時乳酸的含量降低了36.17、 甲酸含量降低了24.39、 乙酸含量 降低了9 .20、 琥珀酸含量降低了13 .43。 由此說明， 本發明篩選的東方伊薩酵母 I.orientalis WTB20042304對果酒中的檸檬酸、 乳酸、 甲酸、 乙酸和琥珀酸都有降解能力， 其中尤其對檸檬酸的降解能力尤為顯著。 0027 以本發明的東方伊薩酵母I.orientalis WTB20042304為降酸酵母， 能對果酒中絕 大部分有機酸起到降解作用， 更重。

19、要的是可以增加果酒的穩定性(裝瓶后還能起到穩定酸 度的作用)， 提升酒的品質。 0028 (2)本發明篩選的東方伊薩酵母I.orientalis WTB20042304加入到藍莓果汁發酵 液中， 若以僅加入了釀酒酵母的藍莓汁發酵液為對照， 同時加入釀酒酵母和東方伊薩酵母 I.orientalis WTB20042304的藍莓汁發酵液在發酵終點時， 藍莓果酒中總酚增加了 7.08， 總黃酮增加了2.93， 花青素的含量增加了7.91。 酚類、 黃酮類和花青素是藍莓 果酒中的重要活性物質， 具有抗氧化、 清除自由基、 抗變異和預防癌變的活性。 DPPH自由基 清除力提升了5.82， FRAP總抗氧。

20、化能力提升了9.58， ABTS自由基清除力提升了5.53， 總還原力提升了4.09， 果酒抗氧化能力的提升有效預防衰老和機體因衰老引起的病變。 因此， 本發明篩選的東方伊薩酵母I.orientalis WTB20042304若應用到藍莓果酒的釀造 中， 則能夠大大提升藍莓果酒的品質。 0029 (4)在發酵制備藍莓果酒的過程中， 從發酵終點的糖含量可證明， 加入本發明東方 伊薩酵母I.orientalis WTB20042304后并不影響釀酒酵母對藍莓酒的發酵進程。 因此加入 東方伊薩酵母I.orientalis WTB20042304后藍莓汁能正常發酵， 發酵終點時酒精度為 11.73， 。

21、SSC為6.81 Bx。 若以僅加入了釀酒酵母的藍莓汁發酵液為對照(發酵終點時pH 3.61)， 而加入本東方伊薩酵母I.orientalis WTB20042304和釀酒酵母后， 發酵終點的pH為 3.92， 進一步證明本發明的東方伊薩酵母I.orientalis WTB20042304有明顯的降酸效果。 0030 (5)以本發明的東方伊薩酵母I.orientalis WTB20042304作為生防菌， 作為生防 說明書 3/15 頁 5 CN 112111416 A 5 菌， 對預先接種了灰葡萄孢菌的葡萄， 對發病率進行統計， 結果為42.22； 在生防菌濃度相 同的情形下， 現有生防菌(。

22、已有菌株， 保藏編號為CGMCC No.14909)的發病率為71.11， 由 此說明， 本發明酵母菌株相比現有生防菌， 對灰葡萄孢菌具有更好的抑制作用。 0031 由此可知， 本發明的東方伊薩酵母I.orientalis WTB20042304不僅能夠在鮮果采 摘后防止鮮果腐爛變質保證其新鮮度， 同時還能夠在后期使用果汁發酵釀酒時起到降酸作 用， 且其降酸作用不受酒精濃度影響， 也不影響釀酒酵母的正常發酵進程， 可對果酒中絕大 多種類的有機酸都能起降酸效果、 提升果酒口感和品相(酸度高酒汁呈渾濁)， 是一株可應 用于果酒制備工藝全程的優選菌株， 在鮮果保鮮儲藏時所噴灑的生防菌懸液即使有部分殘。

23、 留， 其在發酵過程中依然能發揮其降酸效果。 此外， 還能增加果酒中酚類、 黃酮類和花青素 等活性物質的含量， 提升抗氧化和總還原力進一步提升果酒品質。 附圖說明 0032 圖1為本發明篩選的東方伊薩酵母I.orientalis WTB20042304的形態學特征的照 片。 0033 圖2為本發明篩選的東方伊薩酵母I.orientalis WTB20042304的總DNA的PCR電泳 檢測圖譜。 0034 圖3為本發明篩選的東方伊薩酵母I.orientalis WTB20042304的進化樹分析。 具體實施方式 0035 為了更好的解釋本發明， 以便于理解， 下面結合附圖， 通過具體實施方式，。

24、 對本發 明作詳細描述。 0036 一、 菌株的篩選和鑒定 0037 (一)菌株的分離 0038 分別在0d、 3d、 6d、 9d、 12d以及15d對自然發酵的藍莓果酒進行取樣， 將酒樣液于WL 營養瓊脂培養基進行稀釋1000倍、 10000倍和100000倍樣品鋪板， 26恒溫培養48h后獲得 單菌落， 所有實驗均做兩個平行。 挑取單菌落在WL營養瓊脂平板上進行分離純化， 26恒溫 培養48h， 根據酵母菌的形態特征挑取疑似菌落鏡檢， 通過在WL平板上劃線分離， 得到純化 菌種。 0039 (二)東方伊薩酵母I.orientalis WTB20042304的生物學特性 0040 (1)形。

25、態學特征 0041 參見圖1A、 圖1B所示， A代表在WL營養瓊脂 【真菌培養基， 75gWL營養瓊脂培養基溶 于1000mL水中， 分裝后， 121滅菌20min】 上26培養48h的菌落形態， 標尺1cm； B代表在40 倍鏡下觀察到的細胞形態(標尺10 m)。 據觀察， 該菌落形狀不規則， 白色， 平坦， 粗糙； 在顯 微鏡下觀察， 細胞為橢圓形， 直徑在8 m左右。 0042 (1)分子生物學鑒定 0043 采用SDS煮沸法提取該菌株總DNA， 以NL-1和NL-4為引物擴增26s rDNA D1/D2區 目的片段并進行瓊脂糖凝膠電泳分析(電泳條件： 180V,30min)， 結果如。

26、圖2所示； 檢測目的 片段大小正確， 樣品進行DNA測序。 0044 同源性比對與進化樹結果 說明書 4/15 頁 6 CN 112111416 A 6 0045 將測序基因序列與Gene Bank內已知菌株的相應序列進行比對， 在straininfo找 到相應的模式菌株， 通過同源性比對結果構建系統發育進化樹。 參見圖3所示。 結果表明： 菌 株與I.orientalis(EU585754.1),在同一分枝上置信度達到100， 且親緣性很近(距離為 0)從而確定該菌株鑒定為東方伊薩酵母(I.orientalis)。 0046 二、 東方伊薩酵母I.orientalis WTB20042304。

27、的降酸特性 0047 (一)以檸檬酸、 酒石酸為唯一碳源的培養基， 測試東方伊薩酵母I.orientalis WTB20042304的降酸能力 0048 (1)實驗材料 0049 菌株： 東方伊薩酵母I.orientalis WTB20042304、 I.orientalis WTBD2(藍莓果 酒發酵醪液)、 I.orientalis WTBD3(葡萄果酒發酵醪液)、 I.orientalis WTBD3(藍莓果酒 發酵醪液)、 I.orientalis WTBD4(藍莓果酒發酵醪液)、 I.orientalis WTBD5(山楂果酒發 酵醪液)P.cactophila(保藏菌株編號為CGM。

28、CC No.14909) 0050 藥品和試劑 0051 表1藥品和試劑 0052 0053 實驗儀器 0054 表2實驗主要儀器 0055 0056 培養基 0057 檸檬酸培養基： 將1g檸檬酸， 1g酵母浸粉， 2g蛋白胨和0.1g磷酸二氫鉀溶于100mL 說明書 5/15 頁 7 CN 112111416 A 7 水中， 通過121高壓滅菌20min滅菌， 備用。 0058 酒石酸培養基： 將1g酒石酸， 1g酵母浸粉， 2g蛋白胨和0.1g磷酸二氫鉀溶于100mL 水中， 通過121高壓滅菌20min滅菌， 備用。 0059 (2)實驗方法 0060 將培養好東方伊薩酵母I.orie。

29、ntalis WTB20042304、 I.orientalis WTBD2(藍 莓果酒發酵醪液)、 I.orientalis WTBD3(葡萄果酒發酵醪液)、 I.orientalis WTBD3(藍莓 果酒發酵醪液)、 I.orientalis WTBD4(藍莓果酒發酵醪液)、 I.orientalis WTBD5(山楂果 酒發酵醪液)P.cactophila(保藏菌株編號為CGMCC No.14909)， 分別挑取單菌落到裝有5ml YPD培養基的試管中， 在搖床上進行搖瓶16-24h， 以保證其純度和活力， 取出， 去上清液， 加 水清洗后離心3次， 最后加入1ml水定容， 制成菌懸液。

30、。 將制備好的菌懸液梯度稀釋10倍、 100 倍和1000倍， 選用1000倍用血球計數板在顯微鏡下進行細胞計數， 用公式算出菌懸液濃度， 再稀釋至2106CFU/mL。 0061 在96孔板中分別加入100 L上述的加酸培養基(上述檸檬酸培養基、 酒石酸培養 基)以及100 L菌懸液， 每株菌做三個平行。 分別在0h、 24h、 48h、 72h掃描590nm下的吸光度， 并計算與0h吸光度的差值， 通過吸光度的差值來反映菌株生長狀況， 進而判定這些菌株能 否利用相應有機酸進行生長。 0062 (3)單一降酸效果分析 0063 分別準備3份檸檬酸培養基和酒石酸培養基， 每瓶培養基各50mL，。

31、 滅菌備用。 將培 養好的3株菌分別挑取單菌落到裝有5mLYPD培養基的試管中， 在搖床上進行搖瓶16-24h， 以 保證其純度和活力， 取出， 去上清液， 加水離心3次， 最后加入1ml水定容， 制成菌懸液， 并進 行血球計數。 將3株菌分別加入到對應的三角瓶中， 使酵母菌的終濃度均為106CFU/mL， 放入 恒溫搖床中搖瓶， 26， 200rpm， 分別在0h、 48h、 96h進行取樣， 每次取24mL， 在取樣時間點 分別測有機酸含量。 0064 采用液相色譜儀檢測條件： 0065 色譜柱： Agilent 5 TC-C18(2504.6mm)， 以pH為2.4的磷酸氫二氨為流動相，。

32、 柱 溫為45、 流速為0.8ml/min， 進樣量為20 L的色譜條件下分別對含有檸檬酸、 酒石酸的培 養基以及加入3株降酸酵母后的有機酸培養基發酵48h和96h的樣品離心并稀釋20倍后用高 效液相色譜儀進行檢測。 通過檸檬酸、 酒石酸標準品色譜圖結果確定有機酸的保留時間， 并 與0h培養基中各有機酸色譜峰面積的對比， 檢測各菌株的降酸效果。 測試前， 首先將0h檸檬 酸和0h酒石酸培養基的樣品用超純水稀釋20倍， 上樣檢測， 然后分別對48h、 96h的培養基稀 釋并檢測。 0066 標準曲線的建立： 稱取一定量的有機酸標準品放入容量瓶內， 用超純水稀釋配制 成10mg/ml的母液， 用流。

33、動相稀釋成所需濃度， 濃度梯度分別為2.5mg/ml， 2mg/ml， 1mg/ml， 0.4mg/ml， 0.2mg/ml， 0.1mg/ml， 依次進樣得到相應峰面積， 用最小二乘法得到相應線性回 歸方程。 0067 (4)實驗結果 0068 以檸檬酸和酒石酸為唯一碳為唯一碳源降酸效果， 如表3-表5： 0069 表3:相對于實驗開始時在檸檬酸中的OD590增加值 說明書 6/15 頁 8 CN 112111416 A 8 0070 0071 表4:相對于實驗開始時在酒石酸中的OD590增加值 0072 0073 0074 表5:72h檸檬酸和酒石酸的含量 0075 0076 由表3可知，。

34、 向檸檬酸培養基(檸檬酸為唯一碳源)中加入由表3可知， 向檸檬酸培 養基(檸檬酸為唯一碳源)中加入I.orientalis WTB20042304菌株后， 在培養48h、 72h時吸 光度增加1.6以上。 高于其它菌株。 由表4可知， 向酒石酸培養基(酒石酸為唯一碳源)中加入 I.orientalis WTB20042304菌株后， 在培養48h、 72h時吸光度增加1.1以上。 高于其它菌株。 由表5可知， I.orientalis WTB20042304對檸檬酸的降解率達到92.39， 其它菌株均低于 90； 對酒石酸的降解率達到41.04， 其它菌株均低于40。 0077 綜上， 菌株在。

35、利用檸檬酸和酒石酸的能力最強。 說明書 7/15 頁 9 CN 112111416 A 9 0078 (二)東方伊薩酵母I.orientalis WTB20042304對藍莓醪液中有機酸和活性物質 的影響 0079 (1)實驗材料 0080 菌株： 東方伊薩酵母I.orientalis WTB20042304、 I.orientalis WTBD2(藍莓果 酒發酵醪液)、 I.orientalis WTBD3(葡萄果酒發酵醪液)、 I.orientalis WTBD3(藍莓果酒 發酵醪液)、 I.orientalis WTBD4(藍莓果酒發酵醪液)、 I.orientalis WTBD5(山楂。

36、果酒發 酵醪液)P.cactophila(保藏菌株編號為CGMCC No.14909) 0081 藍莓： 由日照尚禮酒廠2019年1月6日提供， 品種為北陸 0082 藥品和試劑 0083 表6藥品和試劑 0084 0085 實驗儀器 0086 表7實驗主要儀器 說明書 8/15 頁 10 CN 112111416 A 10 0087 0088 0089 (2)實驗方法 0090 將藍莓破碎， 然后分裝到3個發酵罐中， 每個發酵罐中放3.5公斤藍莓。 將活化好的 東方伊薩酵母I.orientalis WTB20042304和Pichia cactophila BY35(現有菌株、 保藏菌 株編。

37、號為CGMCC No.14909)分別加入2個發酵罐中， 加菌量為1106CFU/mL， 對照組中不加 任何降酸酵母。 在第3天時再加釀酒酵母， 濃度也為1106CFU/mL， 加糖120g/L。 將發酵罐放 在22的條件下進行發酵， 每天攪拌2次。 待發酵結束后過濾， 果酒濾液密封保存。 0091 (3)藍莓果酒指標測定 0092 a、 理化指標測定 0093 pH值測定： 用pH計測定。 SSC測定： 用糖度計測定。 酒精度測定： 用酒精計測定。 總糖 測定： 苯酚硫酸法， 1mL樣品+0.5mL5苯酚溶液+2.5mL濃硫酸， 混勻5min后， 取出冷卻至室 溫， 分光光度計490nm處測。

38、吸光值。 總酸測定： 根據國標法測定。 0094 b、 活性物質測定 0095 總酚含量的測定參考Singleton 【Singleton V.L.,Rossi J.A.Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic phosphotungstic acid reagentsJ .American Journal of Enology and Viticulture,1965,16:144-158. 】 的方法。 總黃酮含 量根據王友升等的方法 【朱昱燕,王友升,趙茜等.槐花中抗氧化及清除自由基活性物質的 提取條件研究J.食品工業科技,2。

39、009(12):130-132. 】 ， 以蘆丁作標準曲線， 醪液中總酚含 量換算為每克樣品中蘆丁的含量。 花青素含量的測定參考許昆 【許昆.干型藍莓酒的生產工 藝研究D.安徽大學,2014. 】 的方法。 0096 c、 藍莓果酒降酸效果檢測 0097 混合標準品的配制： 固體標準品各取10mg， 液體標準品母液各取100 L， 用流動相 定容至10ml， 混合均勻后， 與4冰箱中避光保存。 使用時用注射器取1ml過45 L微孔膜于液 相小瓶中在最優條件下檢測。 0098 樣品前處理： 首先將樣品用超純水稀釋20倍， 上樣檢測， 然后分別對48h、 96h的培 養基稀釋并檢測。 0099 液。

40、相條件： 色譜柱： Agilent 5 TC-C18(2504.6mm)， 以pH為2.4的磷酸氫二氨為 流動相， 柱溫為45、 流速為0.8ml/min， 進樣量為20 L的色譜條件下分別對含有檸檬酸、 酒 石酸的培養基以及加入2株降酸酵母后的有機酸培養基發酵48h和96h的樣品離心并稀釋20 倍后用高效液相色譜儀進行檢測。 通過檸檬酸、 酒石酸標準品色譜圖結果確定有機酸的保 留時間， 并與0h培養基中各有機酸色譜峰面積的對比， 檢測各菌株的降酸效果。 0100 (4)實驗結果 0101 檸檬酸含量變化 0102 發酵開始時藍莓汁中的檸檬酸含量較高， 為6.81g/L， 而在發酵終點時， 除。

41、對照組 說明書 9/15 頁 11 CN 112111416 A 11 (不加降酸酵母)， 其余2組均未檢測到檸檬酸。 0103 由此說明， I.orientalis WTB20042304酵母在藍莓果酒中對檸檬酸有很強的降解 能力。 0104 乳酸含量變化 0105 發酵開始時的乳酸含量很少， 只有0.08g/L。 通過對比發酵終點與發酵開始時的乳 酸含量可以看出， 釀酒酵母在發酵過程中會產生乳酸， 因此對照組在發酵終點時乳酸含量 為0.94g/L。 具體結果如表8： 0106 表8 0107 0108 0109 此外， 加入本發明篩選的酵母菌株時， 發酵終點的乳酸的含量與對照組相比降低 了。

42、36.17， 明顯優于現有酵母菌株的降乳酸能力， 也優于其他實驗組菌株。 0110 甲酸含量變化 0111 發酵開始時的藍莓汁中檢測到的甲酸只有0.07g/L， 且釀酒酵母在發酵過程中會 產生較多甲酸， 在發酵終點時對照的甲酸含量為0.41g/L。 通過對比發酵終點與發酵開始時 的甲酸含量可以看出， 釀酒酵母在發酵過程中會產生甲酸。 具體結果如表9： 0112 表9 0113 說明書 10/15 頁 12 CN 112111416 A 12 0114 P.cactophila BY35加入到藍莓醪液中后， 反而增加了甲酸的含量， 推測可能是分 解其他有機酸而生成了部分甲酸。 而本發明篩選的I.。

43、orientalis WTB20042304有降解甲酸 的能力， 在發酵終點時甲酸含量為0 .31g/L， 相比對照組下降了24 .39， 其它實驗組 I.orientalis對甲酸的降解均小于10。 0115 乙酸含量變化 0116 發酵開始時藍莓汁中含有極少量的乙酸， 只有0.15g/L， 釀酒酵母在發酵過程中會 產生一定量乙酸， 發酵終點時對照組的乙酸含量達到14.79g/L。 明釀酒酵母在發酵過程中 很容易產生乙酸。 實驗結果如表11。 0117 表10 0118 0119 加入本發明的I.orientalis WTB20042304后， 乙酸的含量相比于對照組降低了 9.20， I.。

44、orientalis WTBD5與I.orientalis WTB20042304對乙酸的降解能力相當， I.orientalis WTBD2相對于對照降低小于5， 其它菌株相對于都對照組乙酸積累高于對 照。 0120 琥珀酸含量變化 0121 發酵開始時藍莓汁中含有極少量的琥珀酸， 只有0.05g/L， 釀酒酵母在發酵過程中 會產生琥珀酸， 發酵終點時對照組的琥珀酸含量為0.67g/L。 通過對比發酵終點與發酵開始 時的琥珀酸含量可以看出， 釀酒酵母在發酵過程中會產生琥珀酸。 具體結果如表10。 0122 表11 0123 說明書 11/15 頁 13 CN 112111416 A 13 0。

45、124 0125 加入本發明的I.orientalis WTB20042304菌株相對于對照組， 琥珀酸降低了 13.43， 而其他菌株相對于對照組琥珀酸的積累均大于對照組。 0126 由此可知， I.orientalis WTB20042304在藍莓果酒發酵中， 對檸檬酸、 乳酸、 甲酸、 乙酸和琥珀酸都有降解作用， 對檸檬酸的降解尤為顯著。 0127 I.orientalis WTB20042304對藍莓果酒中活性物質的影響 0128 對照組在發酵終點時總酚含量為1.13mg/g， 總黃酮含量為1.05mg/g， 花青素含量 為120.29mg/L。 0129 0130 相對于對照組， 加。

46、入菌株I.orientalis WTB20042304， 總酚含量升高10.37高于 其它菌株， 總黃酮含量升高2.93高于其它菌株， 花青素含量7.91高于其它菌株。 0131 表12 0132 說明書 12/15 頁 14 CN 112111416 A 14 0133 0134 相對于對照組， 加入菌株I.orientalis WTB20042304各抗氧化指標都升高， 其中 DPPH升高了9.44， FRAP升高了9.58， ABTS升高了6.50， 總還原力升高了15.92。 其中 FRAP升高量略低于菌株I.orientalis WTBD4， 但其它抗氧化指標均高于I.orienta。

47、lis WTBD4。 0135 I.orientalis WTB20042304對藍莓果酒中pH的影響 0136 加入降酸酵母后的藍莓果酒均能正常發酵， 發酵終點時所有處理的酒精度為 11.73， SSC為6.87 Bx。 發酵終點時對照的pH為3.61。 加入東方伊薩酵母I.orientalis WTB20042304后， 發酵終點pH為3.92。 說明本發明的I.orientalis WTB20042304有明顯的降 酸效果。 0137 (四)東方伊薩酵母I.orientalis WTB20042304對鮮果的生防效果 0138 (1)實驗材料 0139 菌株： 酵母菌： 東方伊薩酵母I.。

48、orientalis19724 0140 病原菌： 灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)， 為本實驗室保存 0141 水果： 葡萄， 購買于北京新發地 0142 實驗主要儀器， 參見表2 0143 (2)實驗方法 0144 步驟1： 配制酵母菌菌懸液， 作為生防菌菌懸液， 包括如下步驟： 0145 活化菌株： 在YPD平板上取1個單菌落接種到YPD液體培養基， 26搖床培養24h。 0146 收集菌體： 離心， 去除培養基， 加入1mL無菌水沖洗(用移液槍吹打或者震蕩混 勻)， 12000r/min， 4， 2min離心。 此操作重復三次。 去水， 留下菌體后， 加入1mL無菌水混勻。

49、， 稀釋到合適倍數。 0147 血球板計數： 先蓋上載玻片， 在上室和下室分別加入10 L菌懸液， 首先用10倍鏡 找到方格， 再換40倍鏡計數。 計數后稀釋成目標濃度懸浮液。 0148 步驟2： 配制霉菌菌懸液 0149 在滅菌的10mL離心管中加入2mL無菌水， 用滅菌的鑷子夾取培養基表面的菌絲， 加 入離心管中， 用移液槍吹打混勻， 使孢子完全混入水中， 用濾布過濾后用血球計數板計數， 稀釋成5104CFU/mL濃度孢子懸浮液。 0150 步驟3： 果實準備 說明書 13/15 頁 15 CN 112111416 A 15 0151 將買回來的葡萄進行挑選， 將有碰傷和損壞的單獨放， 將。

50、挑選出來的成熟度和大 小一致的好果用清水洗凈， 再用次氯酸鈉水溶液(0.5)處理5min， 然后擺放到經過清洗的 盒子里面， 每盒15個葡萄， 待葡萄表面水分晾干后， 用刺傷針開始刺傷， 每個果實刺傷1個 孔， 每次刺傷一盒將接種針灼燒。 待葡萄的汁液晾干后(大約4h)， 實驗組加入20 L目的濃度 酵母菌懸液， 在4h后(基本上酵母菌懸液被完全吸收)加入20 L病原菌5104CFU/mL的孢子 懸浮液， 對照組也加入無菌水20 L， 裝框時在框內放入倆團用水打濕的衛生紙球。 0152 步驟4： 對發病(腐爛)情況進行統計 0153 腐爛率的統計方法采用觀察法， 計算公式為： 腐爛率()爛果數。