巖原鯉親子鑒定試劑盒及其微衛星PCR鑒定方法.pdf

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1、(19)中華人民共和國國家知識產權局 (12)發明專利申請 (10)申請公布號 (43)申請公布日 (21)申請號 202011240382.7 (22)申請日 2020.11.09 (71)申請人 水利部中國科學院水工程生態研究 所 地址 430079 湖北省武漢市洪山區卓刀泉 雄楚大街578號 (72)發明人 闕延福李偉濤朱濱胡興坤 徐念熊美華邵科汪鄂洲 田華 (74)專利代理機構 湖北武漢永嘉專利代理有限 公司 42102 代理人 喬宇 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (5。

2、4)發明名稱 巖原鯉親子鑒定試劑盒及其微衛星PCR鑒定 方法 (57)摘要 本發明公開了巖原鯉親子鑒定試劑盒及其 微衛星PCR鑒定方法。 提取巖原鯉個體樣本的基 因組DNA； 進行PCR擴增： 巖原鯉親子鑒定用引物 組中的20對微衛星引物的每對引物的正向引物 的5 端標記上熒光物質， 利用上述引物組中的各 標記熒光引物對獲得的DNA基因組進行梯度PCR 擴增， 擴增產物在測序儀上進行毛細管電泳， 讀 取每個個體的等位基因大小， 獲取基因分型數 據； 巖原鯉家系的親子鑒定分析： 基于基因型數 據進行親本和子代數據分析， 根據子代基因型和 親本基因型之間的相關性， 確定子代與親本間的 親子關系。 。

3、本發明方法簡單、 快捷、 高效、 經濟， 可 在巖原鯉繁殖群體的家系管理、 群體遺傳變異研 究和增殖放流效果評估提供技術途徑。 權利要求書3頁 說明書9頁 序列表9頁 附圖2頁 CN 112126693 A 2020.12.25 CN 112126693 A 1.基于微衛星標記的巖原鯉親子鑒定用引物組， 其特征在于： 分別為： Prora002、 Prora003、 Prora048、 Prora050、 Prora054、 Prora055、 Prora066、 Prora071、 Prora074、 Prora075、 Prora079、 Prora085、 Prora089、 Prora。

4、093、 Prora096、 Prora098、 Prora100、 Prora102、 Prora103、 Prora106引物， 各引物序列如下表： 權利要求書 1/3 頁 2 CN 112126693 A 2 2.根據權利要求1所述的引物組， 其特征在于： 每對引物的正向引物的5 端標記有熒光 物質， 所述的熒光物質選自FAM或HEX。 3.根據權利要求1所述的引物組， 其特征在于： 基于微衛星標記的巖原鯉親子鑒定用引 物組分成10個組合； 10個組合分別如下： 組合1為Prora002引物和Prora106引物， 組合2為 Prora089引物和Prora003引物， 組合3為Pror。

5、a048引物和Prora103引物， 組合4為Prora066 引物和Prora071引物， 組合5為Prora074引物和Prora055引物， 組合6為Prora085引物和 Prora100引物， 組合7為Prora096引物和Prora075引物， 組合8為Prora093引物和Prora050 引物， 組合9為Prora098引物和Prora054引物， 組合10為Prora102引物和Prora079引物。 4.一種基于微衛星標記的巖原鯉親子鑒定試劑盒， 包括Taq酶PCR預先混合液、 權利要 求1所述的巖原鯉親子鑒定用的引物組， 其中Taq酶PCR預先混合液主要成分為0.1U/ 。

6、l Taq DNA聚合酶、 2X PCR反應緩沖液、 3mM MgCl2， 以及0.4mM dNTPs。 5.根據權利要求4所述的試劑盒， 其特征在于： 所述的巖原鯉親子鑒定試劑盒還包括雙 蒸水。 6.一種微衛星PCR鑒定方法， 包括以下步驟： (1)提取巖原鯉個體樣本的基因組DNA； (2)PCR擴增： 將巖原鯉親子鑒定用引物組中的的20對微衛星引物)中的正向引物的5 端標記上熒光物質， 利用上述引物組中的各對引物對步驟(1)獲得的DNA基因組進行梯度 PCR擴增， 擴增產物在測序儀上進行毛細管電泳， 讀取每個個體的等位基因大小， 獲取基因 分型數據； (3)巖原鯉家系的親子鑒定分析： 基于。

7、步驟(3)獲取的基因型數據進行親本和子代數據 分析， 根據子代基因型和親本基因型之間的相關性， 確定子代與親本間的親子關系。 7.根據權利要求6所述的微衛星PCR鑒定方法， 其特征在于： 所述的PCR擴增程序為： 95 預變性5min； 95變性30s， 6252梯度溫度(touch down)退火30s， 72延伸30s， 進 行10個循環； 95變性30s， 52退火30s， 72延伸30s， 進行22個循環； 最后72再延伸 20min。 8.根據權利要求6所述的微衛星PCR鑒定方法， 其特征在于： 所述的PCR反應體系為： 5.0uL Taq酶PCR預先混合液(主要成分為0.1U/ l。

8、 Taq DNA聚合酶、 2X PCR反應緩沖液、 3mM MgCl2， 以及0.4mM dNTPs)、 1.0uL巖原鯉基因組DNA、 上下游擴增引物各0.4uL(濃度10uM)， 加3.2uL ddH2O至總體積10uL。 9.根據權利要求6所述的微衛星PCR鑒定方法， 其特征在于： 所述的步驟(1)為： 將巖原 鯉親本的鰭條和子代魚苗個體， 采用高鹽提取法獲得每個個體的基因組DNA， 保存備用； 巖 原鯉基因組DNA的濃度為30-50ng/uL。 10.根據權利要求6所述的微衛星PCR鑒定方法， 其特征在于： 步驟(2)中的測序為對如 下各組合： 組合1(Prora002和Prora10。

9、6)、 組合2(Prora089和Prora003)、 組合3(Prora048和 Prora103)、 組合4(Prora066和Prora071)、 組合5(Prora074和Prora055)、 組合6(Prora085 和Prora100)、 組合7(Prora096和Prora075)、 組合8(Prora093和Prora050)、 組合9 權利要求書 2/3 頁 3 CN 112126693 A 3 (Prora098和Prora054)、 組合10(Prora102和Prora079)， 進行組合測序。 權利要求書 3/3 頁 4 CN 112126693 A 4 巖原鯉親子鑒。

10、定試劑盒及其微衛星PCR鑒定方法 技術領域 0001 本發明涉及魚類育種和分子標記技術領域， 涉及一種基于微衛星標記對巖原鯉進 行親子鑒定的技術， 具體涉及巖原鯉親子鑒定試劑盒及其微衛星PCR鑒定方法。 背景技術 0002 巖原鯉(Procypris rabaudi Tchang)屬鯉形(Cypriniformes)、 鯉科 (Cyprinidae)、 鯉亞科(Cypininae)， 原鯉屬(Procypris)， 地方名巖鯉、 黑鯉、 巖鯉巴等。 分 布于宜昌以上長江干流及支流， 是一種棲居于巖石縫間的底層魚類， 以嘉陵江、 岷江和金沙 江較多， 現為四川、 重慶等地的野生名貴經濟魚類之一。。

11、 由于巖原鯉分布區域相對狹窄， 種 群數量小， 再加上過度捕撈、 長江水域污染， 以及長江上游干支流筑壩建閘等原因， 導致巖 原鯉適宜棲息地大規?？s減， 造成了巖原鯉野生資源日益枯竭， 已被 中國瀕危動物紅皮 書 列為易危物種， 為增殖保護這一名貴魚類資源， 需對巖原鯉進行人工增殖放流， 開展種 資資源保護、 恢復與資源增殖研究非常重要。 0003 多年來， 有關巖原鯉營養特性、 人工養殖和繁殖技術等的研究已非常成熟， 增殖放 流的規模大， 區域廣。 僅以金沙江溪洛渡向家壩水電站珍稀特有魚類增殖放流站為例， 自 2008-2019年的12年里， 累計放流超過64.7萬尾， 占放流總量的36.6。

12、。 此外， 金沙江中游金 沙、 觀音巖、 龍開口等魚類增殖站均有放流該種類， 還有四川、 重慶、 云南、 貴州等省市持續 開展了巖原鯉魚類增殖放流， 因此， 長江流域年放流的巖原鯉苗種可達到百萬尾規模。 因 此， 面對多省份、 多機構的巖原鯉放流親本來源于不同家系， 如何快速有效辨別不同的巖原 鯉家系及來源， 探究各放流機構對該區域巖原鯉資源量的增殖效果貢獻， 已成為巖原鯉種 群資源恢復的重要研究課題之一。 0004 微衛星(Microsatellite)是一類廣泛存在于真核生物基因組中的具有高度變異 性的簡單重復DNA序列。 它具有按照孟德爾方式分離、 多態信息含量豐富、 呈共顯性遺傳等 特。

13、點， 可簡便快速的基因型檢測， 是一種廣泛應用的遺傳學分子標記。 同時， 由于微衛星標 記的使用簡單、 結果穩定、 費用低廉， 已經在親子鑒定中有較多的應用。 目前， 尚未發現將微 衛星標記應用于巖原鯉親子鑒定的研究報道。 本發明旨在基于微衛星標記建立巖原鯉的親 子鑒定技術， 可在巖原鯉繁殖群體的家系管理、 種質鑒定、 群體遺傳變異研究和增殖放流效 果評估提供技術途徑。 發明內容 0005 本發明涉及一種基于微衛星標記的巖原鯉親子鑒定試劑盒及其微衛星PCR鑒定方 法。 0006 本發明采用的技術方案如下： 0007 提供基于微衛星標記的巖原鯉親子鑒定用引物組， 分別為： Prora002、 P。

14、rora003、 Prora048、 Prora050、 Prora054、 Prora055、 Prora066、 Prora071、 Prora074、 Prora075、 Prora079、 Prora085、 Prora089、 Prora093、 Prora096、 Prora098、 Prora100、 Prora102、 說明書 1/9 頁 5 CN 112126693 A 5 Prora103、 Prora106引物， 各引物序列如下表： 0008 0009 0010 按上述方案， 每對引物的正向引物的5 端標記有熒光物質， 所述的熒光物質選自 FAM或HEX。 說明書 2/9。

15、 頁 6 CN 112126693 A 6 0011 按上述方案， 20個位點分成10個組合； 10個組合分別如下： 組合1為Prora002引物 和Prora106引物， 組合2為Prora089引物和Prora003引物， 組合3為Prora048引物和 Prora103引物， 組合4為Prora066引物和Prora071引物， 組合5為Prora074引物和Prora055 引物， 組合6為Prora085引物和Prora100引物， 組合7為Prora096引物和Prora075引物， 組合 8為Prora093引物和Prora050引物， 組合9為Prora098引物和Prora0。

16、54引物， 組合10為 Prora102引物和Prora079引物。 0012 提供一種基于微衛星標記的巖原鯉親子鑒定試劑盒， 包括Taq酶PCR預先混合液、 上述巖原鯉親子鑒定用的引物組， 其中Taq酶PCR預先混合液主要成分為0.1U/ l Taq DNA 聚合酶、 2X PCR反應緩沖液、 3mM MgCl2， 以及0.4mM dNTPs； 巖原鯉基因組DNA的濃度為30- 50ng/uL。 0013 按上述方案， 所述的巖原鯉親子鑒定試劑盒還包括雙蒸水。 0014 提供一種微衛星PCR鑒定方法， 包括以下步驟： 0015 (1)提取巖原鯉個體樣本的基因組DNA； 0016 (2)PCR。

17、擴增： 將巖原鯉親子鑒定用引物組中的的20對微衛星引物)中的正向引物 的5 端標記上熒光物質， 利用上述引物組中的各對引物對步驟(1)獲得的DNA基因組進行梯 度PCR擴增， 擴增產物在測序儀上進行毛細管電泳， 讀取每個個體的等位基因大小， 獲取基 因分型數據； 0017 (3)巖原鯉家系的親子鑒定分析： 基于步驟(3)獲取的基因型數據轉換成生物軟件 能夠讀取的格式， 進行親本和子代數據分析， 根據子代基因型和親本基因型之間的相關性， 確定子代與親本間的親子關系。 0018 按上述方案， 所述的步驟(1)為： 將巖原鯉親本的鰭條和子代魚苗個體， 采用高鹽 提取法獲得每個個體的基因組DNA， 保。

18、存備用 0019 按上述方案， 所述的PCR擴增程序為： 95預變性5min； 95變性30s， 6252 梯度溫度(touch down)退火30s， 72延伸30s， 進行10個循環； 95變性30s， 52退火30s， 72延伸30s， 進行22個循環； 最后72再延伸20min。 0020 按上述方案， 所述的PCR反應體系為： 5.0uL Taq酶PCR預先混合液(主要成分為 0.1U/ l Taq DNA聚合酶、 2X PCR反應緩沖液、 3mM MgCl2， 以及0.4mM dNTPs)、 1.0uL模板基 因組DNA(濃度30-50ng/uL)、 上下游擴增引物各0.4uL(濃。

19、度10uM)， 加3.2uL ddH2O至總體積 10uL。 0021 按上述方案， 步驟(2)中的測序為對如下各組合： 組合1(Prora002和Prora106)、 組 合2(Prora089和Prora003)、 組合3(Prora048和Prora103)、 組合4(Prora066和Prora071)、 組合5(Prora074和Prora055)、 組合6(Prora085和Prora100)、 組合7(Prora096和 Prora075)、 組合8(Prora093和Prora050)、 組合9(Prora098和Prora054)、 組合10(Prora102 和Prora0。

20、79)， 進行組合測序。 本發明根據PCR產物大小進行組合， 將20個微衛星位點引物分 成10個組合， 其中各引物組合內PCR產物相互不干擾， 穩定且清晰， 將其擴增的PCR產物混合 為一個基因型分析樣品， 相比單個微衛星PCR擴增的基因型分析樣品， 具有省時高效、 經濟 節約的優點； 0022 本發明基于精心篩選的20個多態性微衛星位點， 開展熒光標記微衛星引物， 進行 PCR擴增實驗， 獲取親本和子代的微衛星分型信息， 獲得家系中親本和子代的基因型數據， 說明書 3/9 頁 7 CN 112126693 A 7 最后開展親子鑒定分析， 分析親本和子代基因型間的相關性， 從而確定子代與親本間。

21、的親 子關系關系。 0023 本發明與現有技術相比， 具有以下優點： 0024 (1)本發明利用熒光標記的微衛星位點與毛細管電泳技術相結合， 依據高通量測 序的微衛星分型， 對巖原鯉家系進行了親子分析； 0025 (2)本發明根據PCR產物大小的范圍， 將20個引物進一步分成10個小組合， 既保證 了微衛星分型數據的準確、 互不干擾， 而且按照擴增產物大小進行優化組合， 將標記兩種不 同顏色熒光物質(如FAM、 HEX)的引物擴增的PCR產物混合為一個基因型分析樣品， 相比單個 微衛星PCR擴增的基因型分析樣品， 雙重PCR的基因型分析具有省時高效、 經濟節約的優點。 0026 (3)本發明提。

22、供的微衛星位點引物針對的20個多態性微衛星位點， 主要為三堿基、 四堿基或五堿基重復單元的位點， 其擴增效果穩定、 清晰， 為后期數據規整提供了較客觀的 依據。 0027 (4)本發明的建立為巖原鯉繁殖群體的家系管理、 群體遺傳變異研究和增殖放流 效果評估提供了一種新的技術手段。 附圖說明 0028 圖1為組合1(位點Prora002和Prora106)微衛星分型圖(依次為子代個體Z05(基因 型分別為144/148、 212/217)、 父本Q01(基因型分別為144/148、 212/217)、 母本Q03F(基因型 分別為144/148、 212/212)， 子一代兩個等位基因分別來自父。

23、本和母本， 符合孟德爾分離定 律； 0029 圖2為組合5(位點Prora074和Prora055)微衛星分型圖(依次為子代個體Z05(基因 型分別為178/183、 243/243)、 父本Q01(基因型分別為173/183、 238/243)、 母本Q03F(基因型 分別為173/178、 243/243)， 子一代兩個等位基因分別來自父本和母本， 符合孟德爾分離定 律； 0030 圖3為組合10(位點Prora102和Prora079)微衛星分型圖(依次為子代個體Z05(基 因型分別為170/170、 279/282)、 父本Q01(基因型分別為167/170、 279/282)、 母本。

24、Q03F(基因 型分別為170/170、 282/282)， 子一代兩個等位基因分別來自父本和母本， 符合孟德爾分離 定律。 具體實施方式 0031 實施例： 0032 下面結合實例， 對本發明作進一步說明。 0033 巖原鯉親子鑒定試劑盒及其微衛星PCR鑒定方法， 其步驟是： 0034 (1)提取巖原鯉個體樣本的基因組DNA： 將經過人工配對獲取的家系4尾親本和86 尾子代魚苗的樣品取出來， 按照高鹽法提取基因組DNA。 具體步驟為： 剪取0.5g左右的鰭條 組織(子代魚苗個體用全部魚苗用做)， 用雙蒸水洗凈保存樣品沾附的酒精， 充分剪碎， 放入 1.5mL離心管中； 向離心管中加入500 。

25、L的細胞裂解液和6 L的蛋白酶K， 在55水浴過夜消 化， 前30分鐘搖動數次； 加500 L氯化鈉(4.5mol/L)， 300 L氯仿， 搖床中速混勻20分鐘， 在 13000rpm， 10下離心10分鐘； 轉移上清液到新管(大概850 L左右)， 加595 L無水異丙醇， 說明書 4/9 頁 8 CN 112126693 A 8 搖床中速混勻20分鐘， 在13000rpm， 10下離心10分鐘， 倒掉上清； 加500 L 75的乙醇， 在 55水浴消化5分鐘， 在13000rpm， 10下離心20分鐘， 倒掉上清； 將離心管置于超凈工作臺 中干燥1小時， 加入50100 L的TE 8.0。

26、， 4過夜溶解DNA， 放置于-20冰箱保存備用。 0035 (2)多態性微衛星位點引物的獲得： 對20個微衛星位點設計合成系列上、 下游引 物， 并分別對8個巖原鯉個體(步驟(1)提取的基因組DNA)進行PCR擴增， 篩選出擴增穩定、 結 果清晰， 特異性強、 雜合度高的引物。 其PCR反應體系為： 5.0uL 2Power Taq PCR預先混合 液(主要成分為0.1U/ l Taq DNA聚合酶、 2X PCR反應緩沖液、 3mM MgCl2， 以及0.4mM dNTPs)、 1.0uL模板基因組DNA(濃度30-50ng/uL)、 上下游擴增引物各0.4uL(濃度10uM)， 加 3.。

27、2uL ddH2O至總體積10uL。 PCR擴增程序為： 95預變性5min； 95變性30s， 6252梯 度溫度(touch down)退火30s， 72延伸30s， 進行10個循環； 95變性30s， 52退火30s， 72 延伸30s， 進行22個循環； 最后72再延伸20min。 獲得的PCR產物進行定量稀釋后， 取1ul PCR稀釋產物， 加入7ul甲酰胺(含4熒光內標LIZ500)變性后， 在ABI 3730 xl DNA測序儀上 進行毛細管熒光電泳檢測和基因分型。 本發明中的20對可用巖原鯉微衛星引物： Prora002、 Prora106、 Prora089、 Prora00。

28、3、 Prora048、 Prora103、 Prora066、 Prora071、 Prora074、 Prora055、 Prora085、 Prora100、 Prora096、 Prora075、 Prora093、 Prora050、 Prora098、 Prora054、 Prora102、 Prora079。 有關巖原鯉微衛星位點， 重復單元、 引物序列及退火變性信 息， 請見表1； 0036 表1 20個微衛星位點信息表 0037 說明書 5/9 頁 9 CN 112126693 A 9 0038 0039 本發明對每對引物進行了具體驗證， 結果表明各引物均符合孟德爾分離定律，。

29、 其 中： 以位點組合1(位點Prora002和Prora106)， 組合5以及組合10為例進行具體分析如下： 圖 1為組合1(位點Prora002和Prora106)的微衛星分型圖(依次為子代個體Z05(基因型分別為 144/148、 212/217)、 父本Q01(基因型分別為144/148、 212/217)、 母本Q03F(基因型分別為 144/148、 212/212)， 子一代兩個等位基因分別來自父本和母本， 符合孟德爾分離定律； 圖2 為組合5(位點Prora074和Prora055)微衛星分型圖(依次為子代個體Z05(基因型分別為 178/183、 243/243)、 父本Q0。

30、1(基因型分別為173/183、 238/243)、 母本Q03F(基因型分別為 173/178、 243/243)， 子一代兩個等位基因分別來自父本和母本， 符合孟德爾分離定律； 圖3 為組合10(位點Prora102和Prora079)微衛星分型圖(依次為子代個體Z05(基因型分別為 170/170、 279/282)、 父本Q01(基因型分別為167/170、 279/282)、 母本Q03F(基因型分別為 170/170、 282/282)， 子一代兩個等位基因分別來自父本和母本， 符合孟德爾分離定律。 0040 (3)熒光標記的微衛星引物進行PCR擴增： 將步驟(2)中的20對微衛星。

31、引物按照PCR 產物大小， 兩對引物組合成一個組合， 共計組成10個組合， 將每個組合中的兩個引物的正向 引物的5 端分別標記FAM和HEX熒光物質， 利用標記熒光引物對步驟(1)獲得的DNA基因組進 行梯度PCR擴增， 其PCR反應體系為： 5.0uL 2Power Taq PCR預先混合液(主要成分為 0.1U/ L Taq DNA聚合酶、 2X PCR反應緩沖液、 3mM MgCl2， 以及0.4mM dNTPs)、 1.0uL模板基 說明書 6/9 頁 10 CN 112126693 A 10 因組DNA(濃度30-50ng/uL)、 上下游擴增引物各0.4uL(濃度10uM)， 加3。

32、.1uL ddH2O至總體積 10uL。 PCR擴增程序為： 95預變性5min； 95變性30s， 6252梯度溫度(touch down) 退火30s， 72延伸30s， 進行10個循環； 95變性30s， 52退火30s， 72延伸30s， 進行22個 循環； 最后72再延伸20min。 獲得的PCR產物進行定量稀釋后， 取1ul PCR稀釋產物(可按下 表中的引物組合將兩個不同顏色熒光引物獲得的PCR產物混合上樣)， 加入7ul甲酰胺(含 4熒光內標LIZ 500)變性后， 在ABI 3730 xl DNA測序儀上進行毛細管熒光電泳檢測， 采用 軟件讀取每個個體的等位基因大小， 獲取基。

33、因分型的原始數據。 依據測序儀獲得的分型結 果， 利用軟件GeneMarker v 2.2.0(Holland and Parson， 2011)讀取個體等位基因大小， 并 依據微衛星的重復單元組成進行人工校正。 0041 引物組合如下： 0042 說明書 7/9 頁 11 CN 112126693 A 11 0043 0044 (4)巖原鯉家系的親子鑒定分析： 對步驟(3)獲取的人工校對后的基因型數據， 利 用軟件Cervus 3.0.7(Kalinowski et al.,2010)對親本和子代數據進行等位基因頻率計 算、 模擬分析和親子關系分析， 通過待測子代與親本間的基因型似然率(lo。

34、g Likelihood ratio， LOD)值來分析其相關性， 并在95置信水平下， 確定待測子代與親本間的關系。 結果 顯示， 對雙親未知時單親本而言， 20個位點的非親權累積排除概率(NE-1P)為0.96143838； 對已知單親基因型時的另一親本而言， 20個位點的非親權累積排除概率(NE-2P)為 0.99762913； 當雙親未知時的父母本組合而言， 20個位點的非親權累積排除概率(NE-PP)為 0.99995034。 巖原鯉20個微衛星位點遺傳多樣性和排除概率信息， 詳見表2。 為確保鑒定結 果準確， 依據LOD值大于0， 且與家系記錄數據相一致， 才能確認為親子關系。 結。

35、果顯示， 86尾 子代中有80尾子代個體確認了親子關系， 鑒定準確率為93.02。 以上結果表明， 利用本發 明的基于微衛星標記的巖原鯉親子鑒定試劑盒及其方法能高效快捷實現巖原鯉家系的親 子鑒定分析、 種質管理和增殖放流效果評估的要求。 0045 表2.巖原鯉20個微衛星位點遺傳多樣性和非親權排除概率信息 說明書 8/9 頁 12 CN 112126693 A 12 0046 0047 注： 樣本量為86尾； 偏離哈迪溫伯格平衡檢驗， *極顯著， NS， 不顯著， ND， 不確定。 0048 上述實施例為本發明較佳的實施方式， 但本發明的實施方式并不受上述實施例的 限制， 其他的任何未背離本發。

36、明的精神實質與原理下所作的改變、 修飾、 替代、 組合、 簡化， 均應為等效的置換方式， 都包含在本發明的保護范圍之內。 說明書 9/9 頁 13 CN 112126693 A 13 說明書核苷酸和氨基酸序列表 水利部中國科學院水工程生態研究所 巖原鯉親子鑒定試劑盒及其微衛星PCR鑒定方法 40 PatentIn version 3.5 1 21 DNA 人工序列(Artificial Sequence) Prora002 F 1 CAGTCGAGCTGTCCTCATTTT 2 20 DNA 人工序列(Artificial Sequence) Prora002 R 2 TGAACCCATCTC。

37、TGGTCACA 3 20 DNA 人工序列(Artificial Sequence) Prora003 F 3 CTGTTCATTGCCAAACATGG 4 20 DNA 人工序列(Artificial Sequence) Prora003 R 4 GGAGCCACAGGTAAACGACT 5 序列表 1/9 頁 14 CN 112126693 A 14 21 DNA 人工序列(Artificial Sequence) Prora048 F 5 TCTAGAAAGCCATATTCGCCA 6 20 DNA 人工序列(Artificial Sequence) Prora048 R 6 CAAG。

38、GCGAGGAGAAATACCA 7 20 DNA 人工序列(Artificial Sequence) Prora050 F 7 TCGTTGGACTGAACTGCATC 8 24 DNA 人工序列(Artificial Sequence) Prora050 R 8 TGGGAAGTATGAAAAATCAAGAAA 9 20 DNA 人工序列(Artificial Sequence) Prora054 F 9 TTGGCATATCCCAGCTCTGT 序列表 2/9 頁 15 CN 112126693 A 15 10 21 DNA 人工序列(Artificial Sequence) Prora。

39、054 R 10 CCTTCATGTCATTCCAAACCT 11 20 DNA 人工序列(Artificial Sequence) Prora055 F 11 ATCCCGATGCATTCAGATTT 12 21 DNA 人工序列(Artificial Sequence) Prora055 R 12 CGCTGTAGAACGTGAGATTTT 13 20 DNA 人工序列(Artificial Sequence) Prora066 F 13 CAGGAAGTGTCTGGTTGCTG 14 20 DNA 人工序列(Artificial Sequence) Prora066 R 14 序列表 3。

40、/9 頁 16 CN 112126693 A 16 TTGCAGCCCAAATAATAGGC 15 20 DNA 人工序列(Artificial Sequence) Prora071 F 15 TGTGCTGCCCTTAGTTGTGT 16 20 DNA 人工序列(Artificial Sequence) Prora071 R 16 AAAGCATTGCATTCCATTTG 17 22 DNA 人工序列(Artificial Sequence) Prora074 F 17 TGCTTTGTTCTGTTTGAGTCTG 18 21 DNA 人工序列(Artificial Sequence) Pr。

41、ora074 R 18 CTCTTTTCAGCTTCATTTCCA 19 20 DNA 人工序列(Artificial Sequence) Prora075 F 序列表 4/9 頁 17 CN 112126693 A 17 19 CCTCGCCATCTTTCACATTT 20 22 DNA 人工序列(Artificial Sequence) Prora075 R 20 AAAGTTGGATGCAATAGTGGAC 21 20 DNA 人工序列(Artificial Sequence) Prora079 F 21 TTGCAATCAAGCTGTTGTCAG 22 21 DNA 人工序列(Arti。

42、ficial Sequence) Prora079 R 22 GGCCCTTGTGTTTCCTCATA 23 21 DNA 人工序列(Artificial Sequence) Prora085 F 23 TTCTAGCTGAAAGGCCTCAAA 24 27 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 序列表 5/9 頁 18 CN 112126693 A 18 Prora085 R 24 TTTTCATTGTTATCTTTCATTGTTATC 25 25 DNA 人工序列(Artificial Sequence) Prora089 F 25 CCTTTAAGTGAATGTTA。

43、ATGGATGC 26 26 DNA 人工序列(Artificial Sequence) Prora089 R 26 ACAAAACACATTCTTTGTCAACTTTT 27 23 DNA 人工序列(Artificial Sequence) Prora093 F 27 TGGGATATGGCTCATAACCTTAG 28 21 DNA 人工序列(Artificial Sequence) Prora093 R 28 TGCAGCACATTACTGAGGATG 29 20 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 序列表 6/9 頁 19 CN 112126693 A 19 P。

44、rora096 F 29 CCCCAAACTTTTGGATAGCA 30 20 DNA 人工序列(Artificial Sequence) Prora096 R 30 GGGGTTCTCAAGATGGGTCT 31 20 DNA 人工序列(Artificial Sequence) Prora098 F 31 GCTGTGTTGTGGGCTCTGTA 32 20 DNA 人工序列(Artificial Sequence) Prora098 R 32 TGGTGACACACTCACCACCT 33 21 DNA 人工序列(Artificial Sequence) Prora100 F 33 TGG。

45、TCAGGTCTCCTGCTAAGA 34 22 DNA 序列表 7/9 頁 20 CN 112126693 A 20 人工序列(Artificial Sequence) Prora100 R 34 TGAAGAAACGGCAATTAACACA 35 20 DNA 人工序列(Artificial Sequence) Prora102 F 35 TTCTTCAACCCAATTCCTGC 36 20 DNA 人工序列(Artificial Sequence) Prora102 R 36 TGCATAGCAGCAGAGGCTAA 37 25 DNA 人工序列(Artificial Sequence)。

46、 Prora103 F 37 TTTCAATGAACCATAGACAGACAGA 38 20 DNA 人工序列(Artificial Sequence) Prora103 R 38 TAGCTCCCATCAGTGCCTCT 39 20 序列表 8/9 頁 21 CN 112126693 A 21 DNA 人工序列(Artificial Sequence) Prora106 F 39 AGTTGCTTTGCAACGATTTG 40 24 DNA 人工序列(Artificial Sequence) Prora106 R 40 TCATCTCTCTAATTGTCACACGTC 序列表 9/9 頁 22 CN 112126693 A 22 圖1 圖2 說明書附圖 1/2 頁 23 CN 112126693 A 23 圖3 說明書附圖 2/2 頁 24 CN 112126693 A 24 。